2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景:
  隱球菌(Cryptococcus)系環(huán)境腐生菌,也是重要的機(jī)會(huì)致病真菌,常在免疫功能低下人群引起感染。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是隱球菌病最主要的臨床表現(xiàn),其中隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎(Cryptococca meningitis/meningoencephalitis,CME)是其高病死率的最主要病因。強(qiáng)烈的嗜中樞性是隱球菌病的一個(gè)顯著特點(diǎn),有超過(guò)90%的隱球菌病侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),但目前其機(jī)制不明。血腦屏障便是隱球菌侵襲中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)的必經(jīng)關(guān)卡,所以新生隱球菌侵襲血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)的途徑只能是:或穿過(guò)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞;或穿越細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)。目前有三個(gè)機(jī)制假說(shuō):1.細(xì)胞旁途徑;2.“特洛伊木馬”機(jī)制;3.跨細(xì)胞途徑(即內(nèi)皮細(xì)胞胞吞胞吐)。
  S100A10蛋白是鈣結(jié)合蛋白家族中S100蛋白家族中的一員,存在于很多細(xì)胞的胞漿和胞核中。S100A10蛋白可與膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2)結(jié)合為異四聚體(

3、S100A10)2-(annexinA2)2并作為膜蛋白存在于多種細(xì)胞的細(xì)胞膜上。繼而使纖溶酶原被tPA(組織型纖溶酶原激活劑)、uPA(尿激酶型纖溶酶原激活劑)激活為纖溶酶,同時(shí)激活基質(zhì)金屬蛋白酶,降解細(xì)胞基質(zhì)。它與細(xì)胞的胞吞胞吐、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等密切相關(guān)。
  MMP9蛋白是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶MMPs(Matrixmetalloproteinase,MMP)家族中的一員,包括分子量為92kDa的無(wú)活性形式Pr

4、o-MMP9和82kDa的活性形式MMP9。體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲(chǔ)備MMPs,只有當(dāng)需要MMPs的信號(hào)傳遞到細(xì)胞后才臨時(shí)合成,然后以無(wú)活性的酶原形式分泌到胞外。隨后被激活并呈現(xiàn)瀑布效應(yīng)。MMPs與血腦屏障開(kāi)放有關(guān),其中MMP-9可分解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ、彈性蛋白、微纖維蛋白、層粘連蛋白、骨連蛋白。
  針對(duì)隱球菌感染血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞后上調(diào)S100A10是否影響MMP9的表達(dá),本研究進(jìn)行了深入研究,進(jìn)一步驗(yàn)證MMP9是否在新生隱球菌

5、的嗜中樞性機(jī)制中起到一定作用,并探索抑制MMP9來(lái)保護(hù)血腦屏障的新方法。
  研究目的:
  第一,觀察新生隱球菌通過(guò)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)S100A10影響基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)在mRNA水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)水平的表達(dá);第二,沉默小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP9基因后,驗(yàn)證基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)情況;構(gòu)建該細(xì)胞系體外血腦屏障模型,探究此時(shí)新生隱球菌侵襲血腦屏障的能力;第三,探索基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001

6、對(duì)新生隱球菌穿過(guò)血腦屏障是否有一定的保護(hù)作用,為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
  研究方法:
  第一部分:將慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)細(xì)胞,分別篩選穩(wěn)定下調(diào)S100A10、MMP9以及空載的細(xì)胞系,分別用熒光顯微鏡和qPCR定性和定量驗(yàn)證其下調(diào)程度(該部分已發(fā)表)。以新生隱球菌B3501感染由LV-musS100A10-shRNAb.End3和NC b.End3構(gòu)建的簡(jiǎn)易體外血腦屏障模型,在mR

7、NA水平和蛋白水平檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)表達(dá)量的差異。
  第二部分:將LV-musMMP9-shRNA b.End3和NC b.End3分別構(gòu)建transwell體外血腦屏障模型,新生隱球菌B3501感染該模型,檢測(cè)其穿透血腦屏障的活菌數(shù)和BBB的完整性。
  第三部分:基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑在新生隱球菌性腦炎/腦膜炎防治中的作用初步探索。以小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b.End3)細(xì)胞構(gòu)建體外血腦屏障模型,放置于不同濃

8、度的GM6001環(huán)境中。檢測(cè)GM6001作用時(shí),穿過(guò)血腦屏障的活性隱球菌數(shù)量以及血腦屏障穩(wěn)定性的改變程度,以探討GM6001對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用及最佳濃度。
  結(jié)果:
  第一部分:成功構(gòu)建了NC b.End3細(xì)胞系、LV-musS100A10-shRNA b.End3細(xì)胞系和LV-musMMP9-shRNA b.End3細(xì)胞系,后兩者M(jìn)MP9基因表達(dá)下調(diào)分別在76%和78.8%。經(jīng)S-N-K檢驗(yàn),LV-musS100A1

9、0-shRNA b.End3細(xì)胞系和LV-musMMP9-shRNA b.End3細(xì)胞系與NC組、b.End3組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05,而b.End3組與NC組的MMP9表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(該部分已發(fā)表,見(jiàn)附錄)。
  NC b.End3組與LV-musS100A10-shRNA b.End3設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn),兩組分別與新生隱球菌B3501構(gòu)建相應(yīng)體外血腦屏障感染模型。mRNA水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LV-mus

10、S100A10-shRNA b.End3組在S100A10下調(diào)后,基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)表達(dá)量與NC b.End3組MMP9表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且均較NC組低。
  第二部分:LV-musMMP9-shRNA b.End3和空載NC b.End3分別構(gòu)建體外血腦屏障的新生隱球菌感染模型。驗(yàn)證表明,MMP9下調(diào)后,在mRNA水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白水平分別比較兩組間基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)表達(dá)量的差異,經(jīng)檢

11、驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05。
  在此基礎(chǔ)上,用一定量的新生隱球菌B3501感染相應(yīng)分別構(gòu)建好的兩組transwell體外血腦屏障模型模型,檢測(cè)血腦屏障穩(wěn)定性的下降程度和穿透血腦屏障模型的活菌數(shù),以證明其在不同血腦屏障模型的侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn):第一,LV-musMMP9-shRNAb.End3所構(gòu)建的血腦屏障模型,其跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TEER)的變化幅度與NC-b.End3組相比有明顯差異,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組

12、BBB的TEER變化幅度有差異,而由LV-musMMP9-shRNA b.End3所構(gòu)建的血腦屏障模型在經(jīng)歷新生隱球菌侵襲時(shí)TEER變化幅度小,穩(wěn)定性更高,完整性更好。第二,體外血腦屏障模型中,NC-b.End3組與LV-musMMP9-shRNA b.End3組的transwell下室內(nèi)新生隱球菌數(shù)目隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多,且兩組各時(shí)點(diǎn)菌落負(fù)荷均出現(xiàn)差異,經(jīng)成組T檢驗(yàn),P<0.05,各時(shí)點(diǎn)兩組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  第三部分:小鼠

13、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3構(gòu)建血腦屏障模型,放置于不同濃度金屬蛋白酶抑制劑GM6001的微環(huán)境,統(tǒng)計(jì)B3501穿過(guò)血腦屏障的數(shù)目。結(jié)果提示,GM600110μM處理組,transwell下室的活性菌數(shù)量減少,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  結(jié)論:
  MMP9在新生隱球菌通過(guò)細(xì)胞旁途徑穿透血腦屏障過(guò)程中起到重要作用,其表達(dá)水平依賴于S100A10的表達(dá)情況。
  隱球菌嗜中樞感染時(shí),金屬蛋白酶抑制劑可作為一種血腦屏障保

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