新生隱球菌穿越血腦屏障腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制及其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響.pdf

1、研究背景：新生隱球菌是一種可以引起致死性新生隱球菌性腦膜炎的致病性真菌，特別是在免疫缺陷患者中，一般認(rèn)為是經(jīng)呼吸道引發(fā)感染。近年來新生隱球菌感染發(fā)生率呈明顯上升趨勢，突出表現(xiàn)在艾滋病人群中，已成為艾滋病患者死亡的首要原因。在我國，新生隱球菌性腦膜炎以散發(fā)、非艾滋病人群為主，但其發(fā)病率也呈逐年增加的趨勢，因此對新生隱球菌性腦膜炎的發(fā)病機(jī)制和治療的研究也日益引起重視。 新生隱球菌性腦膜炎感染過程中病菌穿越血腦屏障是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感

2、染的關(guān)鍵步驟，其中穿透內(nèi)皮細(xì)胞層尤為關(guān)鍵。但是目前關(guān)于新生隱球菌如何穿越血腦屏障造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的機(jī)制尚不清楚，對于該機(jī)制的研究成為新生隱球菌性腦膜炎研究領(lǐng)域的一個熱點。有學(xué)者在新生隱球菌模型的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)新生隱球菌；并有研究發(fā)現(xiàn)新生隱球菌通過跨膜作用穿越腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。 研究證實一些物理和化學(xué)因素能夠誘使腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，緊密連接開放，內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，從而使

3、血腦屏障開放程度提高，通透性增加，大分子蛋白等物質(zhì)順利穿越血腦屏障進(jìn)入腦組織。那么，新生隱球菌及其毒力因子能否導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、緊密連接開放，致使血腦屏障通透性增加呢?本課題通過體內(nèi)和體外實驗相結(jié)合，建立新生隱球菌感染血腦屏障模型，運用透射電鏡、掃描電鏡、流式細(xì)胞儀、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)、PAS特殊病理染色和免疫組織化學(xué)等實驗工具和方法，探討新生隱球菌穿越血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制及其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。 研究目的：1、新生隱

4、球菌對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響；2、新生隱球菌對血腦屏障緊密連接的影響；3、新生隱球菌對C57BL/6小鼠大腦皮質(zhì)的影響。 實驗方法：本課題分為兩個部分進(jìn)行。1.體外實驗：應(yīng)用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)建立血腦屏障模型，觀察新生隱球菌對HUVEC的影響。新生隱球菌感染內(nèi)皮細(xì)胞后，透射電鏡觀察新生隱球菌跨越內(nèi)皮細(xì)胞；掃描電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞對新生隱球菌感染的反應(yīng)及新生隱球菌的黏附位置；流式細(xì)胞儀檢測HUVEC的凋亡率；熒光免疫細(xì)

5、胞化學(xué)法檢測內(nèi)皮細(xì)胞中Bcl-2、Bax、ZO-1、IL-6、和VEGF等蛋白的表達(dá)。 2.體內(nèi)實驗：建立新生隱球菌感染C57BL/6小鼠模型。選擇C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對照組(尾靜脈注入生理鹽水)、免疫抑制組(腹腔注射環(huán)磷酰胺)、實驗組(腹腔注射環(huán)磷酰胺+尾靜脈注入菌懸液)。透射電鏡觀察新生隱球菌感染腦組織；病理檢測大腦皮質(zhì)內(nèi)新生隱球菌感染情況；TUNEL法檢測大腦皮質(zhì)內(nèi)細(xì)胞凋亡變化；免疫組織化學(xué)法檢測新生隱球菌感染過程

6、中大腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax、ZO-1、IL-6、VEGF、b-FGF和BDNF等蛋白的表達(dá)。 實驗結(jié)果：1.體外實驗：1.1應(yīng)用HUVEC建立血腦屏障模型，新生隱球菌感染血腦屏障模型，透射電鏡觀察到： 實驗組：2h組：新生隱球菌部分進(jìn)入HUVEC胞漿內(nèi)；6h組：新生隱球菌大部分進(jìn)入HUVEC胞漿內(nèi)；12h組：新生隱球菌完全進(jìn)入HUVEC胞漿內(nèi)。 1.2利用新生隱球菌感染血腦屏障模型，掃描電鏡觀察到：實驗組：新生

7、隱球菌與HUVEC胞膜黏附，HUVEC細(xì)胞間隙內(nèi)發(fā)現(xiàn)新生隱球菌。2h組：HUVEC表面少量微絨毛樣突起包繞新生隱球菌； 6h組：HUVEC表面較多微絨毛樣突起包繞新生隱球菌； 12h組：HUVEC表面大量微絨毛樣突起包繞新生隱球菌。 1.3流式細(xì)胞儀檢測到新生隱球菌感染血腦屏障模型后，隨感染時間HUVEC凋亡率 增加。1.4熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到HUVEC內(nèi)Bax表達(dá)增強(qiáng)、Bcl-2表達(dá)減弱。 1

8、.5熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到HUVEC內(nèi)ZO-1表達(dá)減弱。 1.6熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到HUVEC內(nèi)VEGF和IL-6表達(dá)增強(qiáng)。 2.體內(nèi)實驗：2.1建立新生隱球菌感染C57BL/6小鼠模型PAS染色提示：實驗組：6h：腦組織內(nèi)有少量新生隱球菌； 12h：腦組織新生隱球菌增多； 24h：腦組織見大量新生隱球菌； 72h：腦組織見大量新生隱球菌。 2.2透射電鏡觀察結(jié)果：新生隱球菌24h穿越血

9、腦屏障。 2.3TUNEL法檢測到實驗組大腦皮質(zhì)凋亡細(xì)胞隨時相點的延長逐漸增多。 2.4免疫組織化學(xué)法檢測到實驗組大腦皮質(zhì)Bax蛋白隨時相點的增加表達(dá)增高，Bcl-2蛋白隨時相點的增加表達(dá)降低。 2.5免疫組織化學(xué)法檢測到實驗組大腦皮質(zhì)IL-6、VEGF、b-FGF和BDNF蛋白隨時相點的增加表達(dá)增高，ZO-1蛋白隨時相點的增加表達(dá)減少。 實驗結(jié)論：依據(jù)本實驗結(jié)果，提示新生隱球菌性腦膜炎的發(fā)病機(jī)制主要有：

10、①新生隱球菌的跨膜作用；②腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接開放；③腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；④相關(guān)細(xì)胞因子導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加。 本課題取得的創(chuàng)新和突破點：豐富和發(fā)展了對新生隱球菌性腦膜炎的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識：在驗證了前人提出的新生隱球菌的跨膜作用的基礎(chǔ)上，本實驗結(jié)果提示腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接開放、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、某些相關(guān)細(xì)胞因子導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加亦在新生隱球菌性腦膜炎的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。當(dāng)然，新生隱球菌性腦膜炎的形成是一