絲氨酸蛋白酶介導(dǎo)隱球酵母細(xì)胞穿越血腦屏障機(jī)制及其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究.pdf

1、研究目的 第一部分：檢測(cè)新生隱球菌分泌的胞外蛋白水解酶活性及證明含有絲氨酸蛋白酶。 第二部分：分析各型新生隱球菌菌株的絲氨酸蛋白酶表達(dá)的強(qiáng)弱。 第三部分：研究絲氨酸蛋白酶對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分的作用和影響。 第四部分：探討絲氨酸蛋白酶介導(dǎo)隱球酵母細(xì)胞穿透血腦屏障的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法 該課題分為兩個(gè)部分進(jìn)行。 1.體外實(shí)驗(yàn)： (1)篩選各型具有代表性新生隱球菌36株，經(jīng)活

2、化后配成菌懸液，分別滴菌懸液在含有偶氮白蛋白的蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，在30℃和37℃下觀察因新生隱球菌分泌的胞外蛋白水解酶催化培養(yǎng)基酶底物偶氮白蛋白而出現(xiàn)顏色改變的擴(kuò)清暈環(huán)，測(cè)量其產(chǎn)生廓清率環(huán)(CH)大小，并用CH值比較不同新生隱球菌分泌的胞外蛋白水解酶活性的強(qiáng)弱；以高分泌胞外蛋白水解酶菌株為研究對(duì)象，用含有不同濃度單位絲氨酸蛋白酶抑制劑加入含有偶氮白蛋白的蛋白瓊脂培養(yǎng)基中，測(cè)量其產(chǎn)生廓清率環(huán)(CH)的大小，CH值比較不同濃度單位絲氨酸蛋白

3、酶抑制劑對(duì)蛋白水解酶活性改變的影響，又利用絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑對(duì)絲氨酸蛋白酶的產(chǎn)生影響來證實(shí)胞外蛋白水解酶含有絲氨酸蛋白酶；應(yīng)用酶譜法檢測(cè)特選新生隱球菌菌株培養(yǎng)上清液中所含胞外蛋白水解酶類近似分子量。 (2)菌株芯片(strainmicroarray，SMA)構(gòu)建：將各種菌株活化后離心沉淀獲取菌株的沉淀物包埋固定成形。觀察HE染色病理切片油鏡下確定具有代表性的部位，加以標(biāo)記。在組織蠟塊中穿取標(biāo)記組織，放入已打好孔的空白蠟塊的

4、小孔中，構(gòu)建成SMA；油鏡下觀察SMA絲氨酸蛋白酶表達(dá)強(qiáng)弱。 (3)取小鼠大腦皮層作腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)培養(yǎng)。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)和對(duì)培養(yǎng)成熟的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定；分別將絲氨酸蛋白酶、上清液和菌懸液加入腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液中，不同時(shí)間點(diǎn)利用相差顯微鏡的微測(cè)量尺測(cè)量細(xì)胞的長度、寬度，計(jì)算細(xì)胞的面積，動(dòng)態(tài)觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；采用免疫組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)BMEC中金屬蛋白酶-9(MMP-9)、Tau微管相關(guān)蛋白(Ta

5、u-LRP)和LDL-R低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL-LRP)表達(dá)。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)用免疫抑制狀態(tài)大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)股靜脈注射伊文氏藍(lán)溶液10min后，隨機(jī)分成空白組、實(shí)驗(yàn)組1(經(jīng)右股靜脈注入絲氨酸蛋白酶)、實(shí)驗(yàn)組2(經(jīng)右股靜脈注入特選標(biāo)準(zhǔn)菌株濃縮上清液)、對(duì)照組1(經(jīng)右股靜脈注入菌懸液)、對(duì)照組2(經(jīng)右股靜脈注入絲氨酸蛋白酶+絲氨酸蛋白酶的抑制劑+菌懸液)。12h后，在G激發(fā)波長為620nm狀態(tài)下觀察血腦

6、屏障開放情況。 (2)選擇C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(絲氨酸蛋白酶+菌懸液)、對(duì)照組(絲氨酸蛋白酶+絲氨酸蛋白酶的抑制劑+菌懸液)。尾靜脈接種后制備全腦組織冰凍切片，檢測(cè)MMP-9在各組腦組織中分布情況；不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠的腦組織勻漿研磨，計(jì)數(shù)菌落形成單位(cfu)；同時(shí)在四個(gè)時(shí)相點(diǎn)取近腦膜的腦組織作透射電鏡觀察和病理切片的阿爾辛藍(lán)特染。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.體外實(shí)驗(yàn)： (1)在含有偶氮白蛋白瓊脂培養(yǎng)基平

7、板上，絕大多數(shù)(33/36)新生隱球菌菌株能產(chǎn)生特異性廓清率暈環(huán)(CH)，CH值在30℃和37℃條件下分別為0.558±0.170和0.575±0.169；在37℃條件下測(cè)定的CH值，環(huán)境株為0.570±0.177、臨床株為0.513±0.069、莢膜缺陷株為0.942±0.075、血清A型0.564±0.144、血清B型0.515±0.078和血清D和AD型0.482±0.072。 (2)在37℃條件下，不同濃度絲氨酸蛋白酶抑

8、制劑對(duì)新生隱球菌分泌胞外蛋白水解酶的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：對(duì)照組與不同濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑(0.4mU、0.8mU、1.2mU、1.6mU)實(shí)驗(yàn)組的CH值分別為0.459±0.188、0.188±0.247、0.708±0.169、0.975±0.287和0.733±0.252。 (3)酶解物的凝膠分析法(酶譜法)觀察到缺少考馬氏亮蘭R-250染色的窄的廓清條帶出現(xiàn)在凝膠基質(zhì)上，分子量在200、100、75和50kDa范圍內(nèi)。其中

9、分子量為200和100kDa的條帶均存在于根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果所選用來觀測(cè)的5株新生隱球菌菌株濃縮上清液所作用的酶底物凝膠中。50kDa條帶很弱不易被被觀測(cè)到，但是至少在3個(gè)被分解的底物凝膠測(cè)定中找到。對(duì)照實(shí)驗(yàn)利用糜蛋白酶和凝血酶消化酶底物后，顯示出分子量為25.5kDa和35kDa的廓清條帶，這與糜蛋白酶和凝血酶的分子量大致相符。 (4)構(gòu)建一張含有篩選的36株新生隱球菌菌株芯片(strainmicroarry，SMA)，含36個(gè)

10、位點(diǎn)，在油鏡下觀察免疫組化顯示所有菌株位點(diǎn)中的絲氨酸蛋白酶表達(dá)均為陽性。被切開的菌株細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸蛋白酶陽性著色大多呈片或彌漫分布。已知CHs值越小的菌株，絲氨酸蛋白酶表達(dá)越強(qiáng)。所有篩選的菌株細(xì)胞中絲氨酸蛋白酶高表達(dá)率為67.0％。血清A型、血清B型、血清D型和AD型以及莢膜缺陷株型中絲氨酸蛋白酶高表達(dá)率分別為46.2％、92.3％、66.7％和25％。 (5)利用鼠大腦皮層提取腦微血管段，接種24h以后細(xì)胞貼壁、增殖并發(fā)生遷移

11、。細(xì)胞倍增時(shí)間為60h左右，7d～9d后融合成單層細(xì)胞，12d～14d后發(fā)生接觸抑制。相差顯微鏡下見典型的血管內(nèi)皮細(xì)胞形狀即“鋪路石”狀。細(xì)胞純化是關(guān)鍵，通過剝除腦膜和大血管來減少成纖維細(xì)胞、軟腦膜細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的混雜。 (6)干預(yù)因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞作用的觀察結(jié)果：絲氨酸蛋白酶組觀察結(jié)果：1h后內(nèi)皮細(xì)胞開始收縮，面積變小，在10h細(xì)胞面積只有原來面積的20％；絲氨酸蛋白酶+抑制劑組：細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化；特型菌株濃縮上清液組觀察結(jié)

12、果：與絲氨酸蛋白酶組相同，但是內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化較快，6h后細(xì)胞面積為原來的20％；特選菌株菌懸液+抑制劑組：細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化；特選菌株菌懸液組：2h以內(nèi)細(xì)胞形狀發(fā)生改變，但超過2h培養(yǎng)液變混濁，大片細(xì)胞死亡。 (7)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分在干預(yù)因素下的表達(dá)結(jié)果：MMP-9的OD值：對(duì)照組為0.182±0.031、絲氨酸蛋白酶組為0.420±0.025(P＜0.01VScontrol)和抑制劑組為0.163±0.034；Tau-LR

13、P的OD值：對(duì)照組為0.162±0.047、絲氨酸蛋白酶組為0.370±0.032(P＜0.05VScontrol)和抑制劑組為0.173±0.051；LDL-LRP的OD度值：對(duì)照組為0.157±0.017、絲氨酸蛋白酶組為0.412±0，012(P＜0.05VScontrol)和抑制劑組為0.163±0.022。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)熒光顯微鏡觀察到伊文氏藍(lán)熒光出現(xiàn)在無BBB的腦區(qū)域，各組均呈現(xiàn)界限明確、染色均一的

14、紅色區(qū)域。 (2)C57BL/6小鼠腦組織的MMP-9免疫組織化學(xué)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組表達(dá)增強(qiáng)，陽性信號(hào)主要分布于腦組織錐體絀胞和小膠質(zhì)細(xì)胞漿；對(duì)照組表達(dá)減弱，陽性信號(hào)主要分布于腦組織中微血管壁，少量見于腦組織內(nèi)；空白對(duì)照組未見任何陽性信號(hào)。 (3)實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)透射電鏡觀察結(jié)果：0.5小時(shí)組：新生隱球菌菌株細(xì)胞在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)梭形；1.0小時(shí)組：缺少莢膜的菌株細(xì)胞緊貼著腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞壁；3.0小時(shí)組：缺少莢膜的

15、菌株細(xì)胞在腦組織中有正常的胞漿、核仁、線粒體等；6.0小時(shí)組：腦組織中缺少莢膜的菌株細(xì)胞變形，有芽孢生長； (4)隱球菌的特殊染色病理結(jié)果提示：0.5h腦組織內(nèi)有少量菌體細(xì)胞累積、在1.0h后腦組織菌體細(xì)胞累積量漸增、3.0h-6.0h后腦組織見大量菌體細(xì)胞累積。 (5)不同時(shí)間點(diǎn)菌落形成單位(CFU)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠腦組織勻漿后培養(yǎng)都產(chǎn)生了CFU。但實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CFU明顯的比對(duì)照組多。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

16、 (1)新生隱球菌分泌具有活性的胞外蛋白水解酶并含有絲氨酸蛋白酶成分；臨床分離株比環(huán)境分離株的胞外蛋白水解酶活性強(qiáng)；絲氨酸蛋白酶抑制劑能降低新生隱球菌分泌胞外蛋白水解酶活性；利用酶譜法檢測(cè)到胞外蛋白水解酶由多種分子量的絲氨酸蛋白酶組成。 (2)通過新生隱球菌菌株細(xì)胞芯片，揭示出所有新生隱球菌都含絲氨酸蛋白酶，臨床株比環(huán)境分離株和無莢膜表達(dá)高。 (3)新生隱球菌菌株細(xì)胞自身分泌和引發(fā)外源產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，通過干擾

17、構(gòu)成血腦屏障主要成分的內(nèi)皮細(xì)胞的完整性使得血腦屏障(BBB)開放程度提高；感染過程中MMP-9參與了對(duì)BBB胞外基底膜的破壞；Tau-LRP的過表達(dá)促使內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白的解聚和重組，細(xì)胞與絀胞間和絀胞與基底膜間的粘附連接松解，絀胞間隙的增寬，最終導(dǎo)致微血管通透性升高；LDL-LRP過表達(dá)說明絲氨酸蛋白酶的激活劑(tPA)通過激活絲氮酸蛋白酶誘導(dǎo)了血腦屏障的過度開放。 (4)絲氨酸蛋白酶促使腦組織中MMP-9過表達(dá)；感染腦組織的真