S100A10基因沉默對人軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響.pdf

1、第一部分:shRNA表達(dá)載體構(gòu)建以及有效siRNA序列篩選
　　目的:針對人S100A10基因設(shè)計siRNA序列；使用質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建shRNA表達(dá)載體；重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行有效siRNA序列的篩選。
　　方法;登陸NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫，查找人S100A10基因序列相關(guān)信息。根據(jù)S100A10(NM_002966)基因信息，使用在線siRNA序

2、列設(shè)計軟件，設(shè)計3條針對其CDS區(qū)的siRNA序列。根據(jù)設(shè)計的siRNA序列，設(shè)計兩條互補的shRNA序列，退火后連接到shRNA表達(dá)載體，構(gòu)建shRNA重組表達(dá)載體。陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染shRNA重組表達(dá)載體到慢病毒包裝細(xì)胞系（293TN細(xì)胞），根據(jù)綠色熒(GFP)光判斷細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA及總蛋白，分別使用RealTime-PCR及Westernblotting的方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中S100A1

3、0mRNA及蛋白相對含量，分析比較得出最有效的siRNA序列。
　　結(jié)果:成功查找到S100A10的基因信息并設(shè)計siRNA序列；經(jīng)測序分析，成功構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體；mRNA及蛋白含量檢測結(jié)果顯示，三條siRNA序列對目的基因均有沉默效果，其中1號siRNA序列最為有效，其轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)mRNA及蛋白含量相比較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，分別下降了78.8％和70.5%，統(tǒng)計差異顯著（P＜0.01）。
　　結(jié)論:使用RNAi技術(shù)，可以

4、在細(xì)胞內(nèi)有效沉默S100A10基因。
　　第二部分:重組慢病毒制備及軟骨細(xì)胞的慢病毒感染
　　目的:重組慢病毒的包裝和生產(chǎn)及滴度檢測；人軟骨細(xì)胞的慢病毒感染。
　　方法:使用有效shRNA(pshRNA1-S100A10)表達(dá)載體及慢病毒包裝質(zhì)粒混合物共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞，進(jìn)行重組慢病毒的包裝和生產(chǎn)。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞上清液，使用微孔濾膜過濾除去蛋白碎片，分裝保存并且使用比例稀釋法檢測病毒滴度。分離培養(yǎng)人原代軟骨

5、細(xì)胞(humanchondrocytes,HCs)，預(yù)實驗確定人軟骨細(xì)胞慢病毒感染的最佳MOI值，并且按照最佳MOI值進(jìn)行感染，在感染72h后，通過綠色熒光蛋白表達(dá)確定細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，收集感染后軟骨細(xì)胞，提取其總蛋白，Westernblot檢測S100A10蛋白相對含量。
　　結(jié)果:成功進(jìn)行了重組慢病毒的包裝及滴度測定。成功分離培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞。使用慢病毒途徑感染軟骨細(xì)胞，可取得較高的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率（約90%）。通過慢病毒途徑，在人

6、軟骨細(xì)胞中成功進(jìn)行了S100A10基因的沉默，蛋白檢測結(jié)果顯示，沉默效率達(dá)到了78.2%。
　　結(jié)論:通過慢病毒途徑可在人原代軟骨細(xì)胞中針對S100A10基因進(jìn)行有效沉默。
　　第三部分:S100A10基因沉默對LPS誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響
　　目的:脂多糖（LPS）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞制作體外炎性模型；S100A10基因干預(yù)對于LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響檢測。
　　方法:取軟骨細(xì)胞及病毒感染后的軟骨細(xì)胞

7、，加入濃度1mg/L的LPS，誘導(dǎo)24、48小時后，收集細(xì)胞上清，ELISA檢測細(xì)胞上清中TNFa，IL-1β,及IL-10含量。LPS誘導(dǎo)48小時后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，Westernblotting檢測MAPK炎癥調(diào)控通路。SDS-PAGE電泳分離蛋白，400mA恒流濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，一抗4℃過夜孵育，洗膜，加入二抗室溫反應(yīng)2h，添加化學(xué)發(fā)光底物，曝片后掃描底片，使用光密度分析軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值分析。通過檢測E

8、RK1/2蛋白磷酸化、P38蛋白磷酸化、JNK蛋白磷酸化及NFkB-P65蛋白磷酸化，來觀察S100A10基因沉默對于LPS誘導(dǎo)MAPK通路激活的影響。LPS誘導(dǎo)后48小時，收集細(xì)胞，流式法檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。使用二甲基亞砜(DMSO)配制Fluo3-AM母液，使用前使用1×磷酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度。胰酶消化收集細(xì)胞，使用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入Fluo3-AM熒光探針，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30分鐘，除去Fluo3-AM工作液

9、，用磷酸鹽緩沖液滌細(xì)胞3次，37℃培養(yǎng)箱孵育約30分鐘，流式檢測，激發(fā)波長480~500nm，發(fā)射波長525-530nm。
　　結(jié)果:人原代軟骨細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)24、48小時后，細(xì)胞上清中炎性因子TNFa，IL-1β,及IL-10含量明顯上升，與空白細(xì)胞組比較，差異顯著（P＜0.05）；S100A10基因沉默組，LPS誘導(dǎo)炎性因子上升的趨勢得到了明顯抑制，與單獨LPS誘導(dǎo)組相比較，差異顯著（P＜0.05）；LPS誘導(dǎo)細(xì)胞后48小時

10、，MAPK通路的ERK1/2、P38、JNK及NFkB-P65蛋白磷酸化程度均增強，而S100A10基因沉默組，蛋白磷酸化增強的趨勢得到明顯抑制。同時，鈣離子檢測結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)可以明顯增強軟骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，統(tǒng)計分析，差異顯著（P＜0.05），而S100A10基因沉默組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度則明顯低于LPS單獨誘導(dǎo)組，且差異顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論:LPS誘導(dǎo)人原代軟骨細(xì)胞，可明顯使細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)。S100A10基因沉