尼古丁上調 NEAT1影響人牙周膜細胞炎性反應的研究.pdf

1、牙周炎發(fā)生于連接牙體硬組織和牙槽骨的牙周膜中，是牙周支持組織中的一種嚴重影響口腔健康的疾病，其主要表現為牙周支持組織喪失。吸煙可使牙周炎發(fā)病率升高，加重牙周炎嚴重程度，同時降低牙周手術及非手術治療效果。研究發(fā)現，煙草燃燒時產生的尼古丁可對人體多個組織和器官產生不良影響，其中包括牙周組織。課題組前期研究發(fā)現，尼古丁可作為配體，特異性的與人牙周膜細胞乙酰膽堿受體結合，參與牙周膜細胞炎性表達，但其具體機制仍不明了。越來越多的研究表明，lncR

2、NA作為廣泛存在于細胞內的非編碼RNA，參與了細胞基因轉錄，炎性反應等方面的調控，然而關于lncRNA參與尼古丁引起牙周組織炎性反應的報道較少。由此作者推測：尼古丁與乙酰膽堿受體結合后，可通過影響lncRNA的表達進一步引起牙周組織炎性損傷。本研究旨在探尋lncRNA在吸煙相關性牙周炎致病機制中發(fā)揮的作用，為控制并治愈吸煙相關性牙周炎提供新思路。
　　【目的】
　　本實驗擬通過探究尼古丁不同濃度和時間作用下人牙周膜細胞α7

3、nAChR和lncRNA NEAT1的表達，NEAT1的表達改變對細胞炎性因子表達的影響及可能作用機制，探索lncRNA在尼古丁介導的牙周炎致病機制中的作用。
　　【方法】
　　1、結合酶消化的改良組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細胞，并通過流式細胞實驗對細胞來源進行鑒定。
　　2、分別給予第5代人牙周膜細胞不同時間和濃度尼古丁作用，實時定量PCR檢測細胞中NEAT1和α7 nAChR表達情況，Western Blot檢測α7 n

4、AChR表達情況。確定尼古丁引起NEAT1和α7 nAChR表達改變的最佳作用時間和濃度。之后給予α7 nAChR激動劑尼古丁和/或其抑制劑α-BTX作用，實時定量PCR和原位雜交實驗檢測NEAT1的表達差異。
　　3、給予第5代人牙周膜細胞尼古丁作用后，實時定量PCR檢測IL-ip、IL-6、IL-8和 TNF-α等炎性因子的表達并用ELISA驗證。分別對細胞轉染siRNA抑制NEAT1表達及對細胞轉染質粒特異性擴增NEAT1表

5、達后給予尼古丁作用，隨后再次觀察炎性因子表達改變，探索人牙周膜細胞在尼古丁作用后NEAT1和炎性相關細胞因子表達變化之間的關系。
　　4、分別給予第5代人牙周膜細胞不同時間和濃度尼古丁作用，通過Western Blot和免疫熒光檢測NEAT1結合蛋白SFPQ和NONO的表達量及在細胞核內的分布情況。隨后觀察抑制SFPQ/NONO表達后尼古丁作用下人牙周膜細胞炎性相關細胞因子的表達。
　　【結果】
　　1、體外成功培養(yǎng)人

6、牙周膜細胞。流式細胞檢測結果顯示，人牙周膜細胞表面，間充質細胞表面標志物CD105和CD90表達呈陽性，造血系統(tǒng)細胞表面標志CD14和血管內皮細胞表面標志CD31呈陰性。
　　2、尼古丁可上調人牙周膜細胞NEAT1的表達，其最佳作用條件為10_5M尼古丁作用2h。尼古丁上調α7 nAChR后，NEAT1表達上升，當抑制尼古丁與表達上調的α7 nAChR結合后，NEAT1表達不變。
　　3、尼古丁作用上調人牙周膜細胞NEAT1

7、表達后，可特異性引起下游IL-8表達上升；抑制NEAT1表達后，IL-8表達隨之下降；過表達NEAT1，IL-8表達隨之上升。
　　4、尼古丁作用人牙周膜細胞后，細胞核內蛋白SFPQ和N O N O的表達量雖沒有變化，但分布狀態(tài)由彌散變?yōu)榫奂Ｏ啾扔趩为毮峁哦∽饔?，抑制SFPQ后尼古丁作用可使IL-8表達進一步升高，而抑制NONO卻沒有相似變化。
　　【結論】
　　成功培養(yǎng)并鑒定人牙周膜細胞。尼古丁可通過α7 nACh