免疫炎性反應(yīng)與帕金森病關(guān)系的研究.pdf

1、目的：帕金森病(Parkinson Disease，PD)是一種多發(fā)于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是黑質(zhì)內(nèi)多巴胺(DA)能神經(jīng)元大量減少，使紋狀體中的神經(jīng)遞質(zhì)。DA和乙酰膽堿之間的相互拮抗作用失調(diào)，而導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。臨床上以進(jìn)行性加重的運(yùn)動(dòng)緩慢、肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)異常等為特征。PD患者黑質(zhì)．DA能神經(jīng)元大量減少的機(jī)制目前尚不清楚，但普遍認(rèn)為與多種因素參與有關(guān)，近年來(lái)，諸多研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)與PD關(guān)系密切。小膠

2、質(zhì)細(xì)胞激活能釋放腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)等多種細(xì)胞毒性物質(zhì)促發(fā)DA能神經(jīng)元變性。PD患者的腦和腦脊液TNF-α升高已得到普遍證實(shí)，但作為聯(lián)系神經(jīng)系統(tǒng)和全身其它部分的重要媒介，血液在PD發(fā)生發(fā)展中的作用卻仍很模糊。Dobbs等檢測(cè)PD患者血清TNF-α濃度，發(fā)現(xiàn)有姿勢(shì)障礙者增高，而癥狀控制者濃度正常，表明TNF-α的分泌與PD的臨床嚴(yán)重程度相關(guān)。Bessler等由體外實(shí)驗(yàn)測(cè)得PD中外周血單核細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α也比

3、對(duì)照組增高。PD患者外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)上清液，結(jié)果IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α明顯低于正常對(duì)照。研究結(jié)果有所不同，可能與口服左旋多巴(L-dopa)等藥物治療有關(guān)。有研究表明脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，釋放致炎因子(TNF-α、IL-1α等)和細(xì)胞毒性因子(NO、活性氧ROS等)導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性，因此常用來(lái)模擬機(jī)體感染和免疫激發(fā)狀態(tài)。國(guó)內(nèi)外已有多人采用L

4、PS黑質(zhì)注射誘導(dǎo)的PD模型進(jìn)行研究，但DA能神經(jīng)元的毀損情況不甚一致，而且目前尚不清楚外周血TNF-α的變化究竟如何，它能否反映黑質(zhì)DA能神經(jīng)元?dú)p的情況。本研究旨在通過(guò)于大鼠黑質(zhì)內(nèi)立體定向注射LPS造成一炎癥環(huán)境，研究黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的毀損情況及血清TNF-α與黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性之間的關(guān)系，加深對(duì)PD的免疫機(jī)制的了解，以期為PD的治療提供新的思路。 方法：將30只健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組， 24h、14d、28d三個(gè)組各

5、8只，利用立體定位儀向大鼠右側(cè)的黑質(zhì)致密部注射2μl LPS(5μg/μl，溶于無(wú)菌PBS中)，對(duì)照組6只，于黑質(zhì)內(nèi)定位注射PBS。除24h組外，各組大鼠自術(shù)后7天起行懸空擺動(dòng)試驗(yàn)及其他異常行為觀察。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，深度麻醉后，自右心耳取血，灌注、固定、包蠟、切片。免疫組化染色觀察DA合成限速酶酪氨酸羥化酶(Tyrosine-hydroxylase，TH)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在形態(tài)與數(shù)量上隨時(shí)間的變化情況。用放射免疫法(RIA)測(cè)定各組大鼠血清TN

6、F-μ水平，分析其與黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元損傷的相關(guān)性。結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用兩樣本比較的t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)、單因素方差分析、q檢驗(yàn)和直線相關(guān)分析。 結(jié)果：術(shù)后1周部分大鼠即開(kāi)始出現(xiàn)弓背、震顫、活動(dòng)遲緩、少動(dòng)、嗅探、尾僵直、豎毛、頻繁潔毛、后肢站立等異常行為，少數(shù)大鼠出現(xiàn)自發(fā)性左向旋轉(zhuǎn)行為。14d、28d組的16只鼠中共有14只向左側(cè)擺動(dòng)的次數(shù)/兩側(cè)總次數(shù)的百分比≥70

7、％視為成功模型。24h時(shí)即觀察到右側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元較左側(cè)減少，右側(cè)占左側(cè)的百分比(存留率)為66.0±4.8％，差異有顯著性(P<0.001)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，右側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元逐漸減少，24h、14d、28d和PBS組分別為71.3±5.4、50.5±4.1、49.8±14.3、96.6±7.5個(gè)/片，24h與14d或28d組比較差異有顯著性(P<0.001)，但14d與28d組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)；黑質(zhì)TH陽(yáng)性神

8、經(jīng)元的存留率，24h、14d、28d三個(gè)組間無(wú)顯著性差異，同時(shí)該三組左側(cè)的黑質(zhì)也有不同程度的神經(jīng)元損傷。24h、14d、28d和PBS組大鼠血清TNF-α水平分別為3.22±0.98fmol/ml、3131±0.97fmol/ml、2.26±0.47fmol/ml、0.42±0.18，mol/ml，24h、14d、28d的與PBS組相比較均有顯著性差異(P<0.001或<0.01)，24h、14d的較28d組為高，但24h、14d、28

9、d之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。相關(guān)性分析顯示LPS組大鼠的黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞的存留率與其血清TNF-α水平之間存在負(fù)直線相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。 結(jié)論：本研究以LPS作為誘導(dǎo)劑，摸索了LPS誘導(dǎo)的PD的早期動(dòng)物模型，采用免疫組化和RIA技術(shù)研究了PD與免疫炎性反應(yīng)之間的關(guān)系。研究證實(shí)：1.黑質(zhì)立體定向注射LPS，可以誘導(dǎo)出類似PD早期的動(dòng)物模型，為研究PD與炎性反應(yīng)的關(guān)系奠定基礎(chǔ)；2.炎癥導(dǎo)致的TH陽(yáng)性神經(jīng)元變性呈時(shí)間依賴