微小RNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)過程中血管細(xì)胞黏附分子1表達(dá)的影響.pdf

1、 摘 要 目的 目的 研究微小 RNA(MiRNA,miR-126)及血管細(xì)胞黏附分子 1 （VCAM-1） 在脂多糖刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中的表達(dá)，探討 miR-126 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)過程中VCAM-1 表達(dá)的影響。 方法 方法 HUVEC 培養(yǎng)后分 6 組，空白對(duì)照組，模型組，miR-126 mimic 組，miR-126 inhibitor 組， A 組， B 組， 后 4 組應(yīng)用 Lipofectamin

2、e 2000 脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染 miR-126類似物 （miR-126 mimic） 、 miR-126 抑制劑 （miR-126 inhibitor） 及轉(zhuǎn)染 miRNA mimics 陰性對(duì)照、miRNA inhibitor 陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染 24 h 后加入脂多糖（1 µg/ml）刺激HUVEC,在 8 h 時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的方法檢測 miR-126、VCAM-1 的 mRNA 的表達(dá)水平；Wester

3、n blot 法檢測 VCAM-1 的蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行比較。 結(jié)果 結(jié)果 模型組較空白對(duì)照組 miR-126 mRNA 降低（0.056±0.0041)倍(P<0.01） ，而VCAM-1 mRNA 模型組較空白對(duì)照組升高（12.50±2.55)倍(P<0.01)，VCAM-1 蛋白水平也明顯升高(P<0.01)。轉(zhuǎn)染 miR-126 mimic 的 HUVEC 在脂多糖刺激下，在 8 h 時(shí)間

4、點(diǎn)檢測 miR-126 的表達(dá)， 較對(duì)照組升高 （51.18±2.30） 倍 （P<0.01） ,VCAM-1 mRNA水平則明顯低于陰性對(duì)照組（0.81±0.037）倍(P<0.01） ，VCAM-1 蛋白水平較陰性對(duì)照組也明顯降低(P<0.01） ；轉(zhuǎn)染 miR-126 inhibitor 后，miR-126 的表達(dá)較對(duì)照組降低（0.032±0.011）倍（P<0.01） ，V

5、CAM-1 mRNA 水平高于陰性對(duì)照組（1.42±0.10）倍(P<0.05） ，VCAM-1 蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組也明顯升高(P<0.05） ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 結(jié)論 過表達(dá) miR-126 在 8 h 時(shí)間點(diǎn)下調(diào) VCAM-1 的表達(dá)，提示 miR-126 可能通過抑制黏附分子如 VCAM-1 的表達(dá)，參與抑制脂多糖誘導(dǎo)的 HUVEC 的炎性反應(yīng)。 碩士研究生 碩士研究生 肖星 肖星 (神經(jīng)病學(xué) 神經(jīng)

6、病學(xué)) 指導(dǎo)教師 指導(dǎo)教師 潘旭東 潘旭東 教授 教授 關(guān)鍵詞：微小 關(guān)鍵詞：微小 RNAs RNAs；血管細(xì)胞黏附分子 ；血管細(xì)胞黏附分子 1；脂多糖類；脂質(zhì)體 ；脂多糖類；脂質(zhì)體 目 錄 引言 引言 ………………………………………………………………………………………1 第一章 第一章 材料與方法 材料與方法 ……………………………………………………………………2 1.1 材料 ………………………………………………………………………

7、…………2 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 …………………………………………………………………………2 1.1.2主要儀器和器材 …………………………………………………………………2 1.1.3 主要試劑 …………………………………………………………………………3 1.2 方法 …………………………………………………………………………………3 1.2.1 HUVEC 的培養(yǎng) ……………………………………………………………………3 1.2.2

8、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 …………………………………………………………………………3 1.2.2.1 轉(zhuǎn)染液制備 ……………………………………………………………………4 1.2.2.2 轉(zhuǎn)染過程 ………………………………………………………………………4 1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 …………………………………………………………………………4 1.2.4 RNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time）PCR……………………………………4 1.2.4.1 總

9、RNA 的提取……………………………………………………………………4 1.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ……………………………………………………………………5 1.2.4.3 Real-time PCR …………………………………………………………………5 1.2.5 蛋白免疫印跡（western blot）分析……………………………………………6 1.2.5.1 總蛋白的提取 …………………………………………………………………6 1.

10、2.5.2 試劑配制 ………………………………………………………………………6 1.2.5.3 配制濃縮膠和分離膠 …………………………………………………………7 1.2.5.4 上樣及SDS-PAGE凝膠電泳 ……………………………………………………7 1.2.5.5 轉(zhuǎn)膜 ……………………………………………………………………………7 1.2.5.6 封閉 ……………………………………………………………………………8 1.2.5.7