rVBMDMP對內(nèi)皮細胞管結(jié)構(gòu)形成及細胞外基質(zhì)、黏附分子基因表達的影響.pdf

1、目的:重組血管基膜衍生多功能肽(rVBMDMP)是通過整合抑制腫瘤血管生成和抑制腫瘤細胞增殖兩種治療策略設(shè)計的。我們的前期研究證實:rVBMDMP對某些腫瘤細胞增殖和內(nèi)皮細胞增殖均具有抑制作用。本文的主要目的是探討rVBMDMP通過與內(nèi)皮細胞相互作用發(fā)揮抑制血管生成作用的分子機制。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(HUVE-12)細胞,平皿集落形成法測定rVBMDMP對血清刺激的HUVE-12細胞生長的抑制作用;AO/EB熒

2、光雙染法和DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測rVBMDMP誘導血清激活的HUVE-12細胞凋亡;體外基質(zhì)膠鋪墊和小鼠在體基質(zhì)膠栓內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成實驗,評估 rVBMDMP對血管生長因子刺激的HUVE-12細胞內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成的抑制作用;高通量的細胞外基質(zhì)與黏附分子cDNA芯片測定rVBMDMP對血清激活的HUVE-12細胞血管生成平衡改變所涉及基因的轉(zhuǎn)錄水平表達變化;實時定量PCR驗證cDNA芯片檢測的結(jié)果。
　　結(jié)果:平皿集落形成法表明:rV

3、BMDMP有效抑制血清刺激的HUVE-12細胞生長,呈劑量依賴性。AO/EB雙染色熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):rVBMDMP(0.1,1.0,10.0μM)處理血清刺激的HUVE-12細胞48h后,染色質(zhì)濃縮,細胞核碎裂等典型凋亡形態(tài)的細胞明顯增加,細胞凋亡率分別為11.8％±5.8%,51.9%±10.6%,75.5%±11.6%,與對照組(0.2%±0.8%)比較,具有高度顯著性差異(P<0.05),呈濃度依賴性。DNA瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)

4、:rVBMDMP(1.0μM)處理血清刺激的HUVE-12細胞24h,48h,出現(xiàn)凋亡細胞典型的“梯形”條帶。體外基質(zhì)膠鋪墊96孔板內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成實驗表明:rVBMDMP(1.0,10.0μM)處理組內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)數(shù)目分別為4.1±1.3/孔和3.4±0.9/孔,與對照組(36.1±3.9/孔)比較顯著減少(P<0.01)。小鼠在體基質(zhì)膠栓內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)形成實驗結(jié)果表明:rVBMDMP(1.0,10.0μM)處理組,H.E染色光鏡下觀察5個視野

5、內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)數(shù)目分別為9.0±2.4和8.5±2.1,與對照組(48±6.9)比較顯著減少(P<0.01);DAPI染色熒光顯微鏡下觀察5個視野內(nèi)皮管結(jié)構(gòu)數(shù)目分別為8.0±2.1和7.0±2.6,與對照組(37.0±5.2)比較顯著減少(P<0.01)。cDNA芯片檢測結(jié)果顯示:與未處理組比較,rVBMDMP(1.0μM)處理組轉(zhuǎn)錄水平表達升高超過2倍的基因包括:Collagen4α2,Collagen6α2,Collagen7α1,Co

6、llagen15α1和Collagen27α1;轉(zhuǎn)錄水平表達降低超過50%的基因包括:IntegrinαV,Integrinβ7,Integrinβ8,Integrinα7,Integrinβ2,MMP12,MMP1,MMP11和MMP7。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示:經(jīng)內(nèi)參校正后,與未處理組比較rVBMDMP(0.1,1.0和10.0μM)處理組轉(zhuǎn)錄水平表達升高的基因有:Collagen7α1;轉(zhuǎn)錄水平表達降低的基因包括:integri