淚腺腺樣囊性癌基因表達(dá)譜和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的檢測(cè)及功能研究.pdf

1、目的：本研究擬：(1)檢測(cè)淚腺腺樣囊性癌(lacrima.glan.adenoi.cysti.carcinoma，LGACC)與正常淚腺的差異基因表達(dá)譜，篩選與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因。(2)對(duì)層粘連蛋白(laminin，LN)及IV型膠原在LGACC和正常淚腺中的表達(dá)進(jìn)行mRNA和蛋白質(zhì)水平的驗(yàn)證，確定其與LGACC病理類型的關(guān)系。(3)觀察LGACC與正常淚腺的超微結(jié)構(gòu)，明確腫瘤基底膜(basemen.membrance，BM)改變與病理

2、類型的關(guān)系。(4)運(yùn)用RNA干擾技術(shù)研究LAMB1基因?qū)CC-2細(xì)胞系的生物學(xué)作用。 材料與方法:(1)收集LGACC和正常淚腺標(biāo)本各5例，提取總RNA，體外轉(zhuǎn)錄為aRNA，與全基因組基因芯片雜交，生物信息學(xué)分析二者的全基因表達(dá)譜，獲得顯著表達(dá)差異的候選基因。(2)采用實(shí)時(shí)定量PC.(real-tim.quantitativ.PCR.RT-qPCR)方法檢測(cè)ACC和正常淚腺組織LAMB1和COL4A1基因的表達(dá)水平；免疫組化方

3、法觀察上述基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物--LN和IV型膠原在ACC不同病理分型中的分布形式。(3)收集6例LGACC和2例正常淚腺標(biāo)本行透射電鏡檢查，觀察不同病理分型ACC超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)和BM形態(tài)的改變。(4.PCR檢測(cè)SGACC-2細(xì)胞系上述基因的表達(dá)，合成沉默LAMB1基因的siRNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ACC-2細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)觀察RNAi后增殖活性的改變。 結(jié)果:(1)經(jīng)基因芯片檢測(cè)，ACC有1103個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)；1001個(gè)基因顯著下

4、調(diào)表達(dá)，差異基因主要涉及細(xì)胞代謝、通訊、定位、細(xì)胞周期，及細(xì)胞粘附和增殖等方面。(2.RT-qPCR證實(shí)：ACC與正常淚腺相比，LAMB1和COL4A1基因分別上調(diào)表達(dá)10.06和12.91倍，而PIGR基因下調(diào)至0.27倍，與基因芯片結(jié)果相符。免疫組化證實(shí)ACC較正常淚腺LN及IV型膠原表達(dá)升高，不但瘤細(xì)胞胞漿可見染色，在篩狀和管狀型ACC中，假囊腔的內(nèi)層、瘤細(xì)胞團(tuán)外周的間質(zhì)和BM結(jié)構(gòu)呈連續(xù)或不連續(xù)的條索狀染色；實(shí)性型染色位于瘤細(xì)胞團(tuán)

5、外周，呈不連續(xù)、不規(guī)則的條索狀。(3)超微結(jié)構(gòu)研究顯示，篩狀和管狀型ACC的BM明顯增厚，呈多層，互相交織成網(wǎng)狀，腫瘤細(xì)胞可伸出偽足侵入BM，使其中斷溶解；實(shí)性型ACC細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞外堆積大量溶解的細(xì)胞外基質(zhì)，完整BM結(jié)構(gòu)少見。(4)涎腺ACC-2細(xì)胞系有LAMB1基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染沉默該基因的siRNA，可使基因表達(dá)降至9％。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，細(xì)胞增殖活性明顯下降。 結(jié)論:(1)LGACC和正常淚腺的基因表達(dá)譜顯