不同血糖水平對(duì)冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)前大隱靜脈細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、近年來，雖然經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)技術(shù)的成熟使需行血管重建的冠心病患者數(shù)量明顯減少，冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(coronary artery bypass graftting，CABG)仍是世界范圍內(nèi)治療冠心病最有效的手段之一，有著PCI無法替代的優(yōu)勢(shì)。目前，大隱靜脈(Saphenous vein，SV)已經(jīng)作為最常用的CABG手術(shù)橋血管應(yīng)用多年，但是術(shù)后十年約50％會(huì)發(fā)生

2、嚴(yán)重狹窄或阻塞，糖尿病(diabetes mellitus，DM)更被看做是增加CABG死亡率和術(shù)后并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其高血糖水平對(duì)大隱靜脈病變的進(jìn)展和演變起到了重要作用。糖尿病患者的血管病變通常繼發(fā)于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的改變。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究合并糖尿病的冠心病患者不同血糖水平下其大隱靜脈中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其組織抑制因子(ti

3、ssue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)和ECM基因表達(dá)情況。本文由以下四部分組成:
　　第一部分研究對(duì)象的選取及標(biāo)本的獲取
　　目的：依據(jù)糖尿病患者及血糖水平為分組依據(jù)，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行篩選和臨床資料收集，以盡可能減少其他因素對(duì)研究結(jié)果的影響。方法：本研究共收集了復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心外科行CABG手術(shù)治療的冠心病患者130例。按術(shù)前糖尿病情況，結(jié)合其空腹血糖和糖化血紅蛋白結(jié)果，分

4、為:HG組（有2型糖尿病且無論是否治療其空腹血糖均未較好控制在7.0mmol/L以下者，糖化血紅蛋白較高有參考價(jià)值，54例）;LG組（有2型糖尿病但平時(shí)空腹血糖可長(zhǎng)期控制在7.0mmol/L以下且糖化血紅蛋白蛋白結(jié)果正常者，36例）和對(duì)照組非糖尿病患者，40例）。對(duì)上述患者進(jìn)行臨床資料收集，CABG術(shù)中獲取大隱靜脈標(biāo)本。結(jié)果：各組間僅血糖水平和蛋白尿有顯著差異，年齡、性別等其他特征均相匹配。結(jié)論：從三組研究對(duì)象的術(shù)前臨床資料分析中我們可

5、以發(fā)現(xiàn)，除血糖水平及蛋白尿外，無論性別、年齡還是吸煙史、高血壓、高血脂等其他因素均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故可以盡可能減少上述多種因素對(duì)本研究結(jié)果的影響。
　　第二部分不同血糖水平對(duì)冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)前大隱靜脈細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)影響的基因芯片分析
　　目的：通過細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子基因芯片研究分析獲得的大隱靜脈標(biāo)本細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)情況。方法：患者分組和大隱靜脈標(biāo)本的獲取同正文第一部分。運(yùn)用TRIzol方法提取總RNA后，以

6、總RNA為模板，應(yīng)用GEArray芯片檢測(cè)試劑盒合成生物素標(biāo)記的cDNA探針，cDNA探針變性后與芯片上特異性的cDNA基因片段雜交，洗滌后經(jīng)GEAblocking液封閉，再由抗生蛋白鏈菌素結(jié)合的堿性磷酸酶室溫下孵育，用CDP-Star?化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行化合光學(xué)檢測(cè)。結(jié)果用ScanAlyze掃描，用GEArray Analyzer軟件分析，分析HG組（或LG組）和對(duì)照組芯片上ECM相關(guān)基因熒光信號(hào)強(qiáng)度值，兩者相比即得出Ratio值，Ra

7、tio值大于3者為基因表達(dá)有顯著差異的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因。結(jié)果：基因芯片的84個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因中，HG組有30個(gè)基因表達(dá)有3倍以上差異倍數(shù)，其中24個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，6個(gè)基因表達(dá)下調(diào);LG組則僅有21個(gè)基因表達(dá)有顯著差異，其中16個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，5個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：在暴露于動(dòng)脈系統(tǒng)增加的血流和灌注壓之前，糖尿病患者的大隱靜脈血管細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)異常導(dǎo)致的細(xì)胞外基構(gòu)失衡的病變過程就已經(jīng)開始，而且其嚴(yán)重程度與患者術(shù)前長(zhǎng)期血糖水平

8、呈正相關(guān);LG組糖尿病患者雖然可長(zhǎng)期將血糖控制在正常范圍內(nèi)，使其細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的異常表達(dá)在數(shù)量和程度上都明顯少于HG組患者，但是其與非糖尿病患者相比較仍有顯著差異。通過基因芯片技術(shù)深入至RNA水平揭示了不同血糖水平對(duì)大隱靜脈的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響，從臨床需要上出發(fā)，對(duì)進(jìn)一步研究冠心病患者搭橋術(shù)后大隱靜脈橋血管易于阻塞的機(jī)制有一定裨益。
　　第三部分不同血糖水平對(duì)冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)前大隱靜脈MMP-2、MMP-9、TIMP-

9、2、TIMP-3蛋白表達(dá)影響的Westernblot法分析
　　目的：以Western blot法進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證基因芯片分析結(jié)果的可靠性，研究不同血糖水平對(duì)冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)前大隱靜脈MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3蛋白表達(dá)量的影響。方法：患者分組和大隱靜脈標(biāo)本的獲取同正文第一部分。用RIPA裂解液提取大隱靜脈組織總蛋白，取部分樣品，SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。

10、用含脫脂奶粉的TBST封閉液進(jìn)行封閉后，分別加入MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3及β-actin(1∶400稀釋)一抗，孵育洗膜后加適量辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，孵育漂洗后用Luminol(R)化學(xué)發(fā)光底物將其覆蓋，取出PVDF膜，放在干凈的濾紙上以去除剩余的化學(xué)發(fā)光底物溶液，而后將其轉(zhuǎn)入干凈的塑料袋中，驅(qū)除氣泡，用X-射線底片曝光。底片經(jīng)掃描儀透掃后凝膠分析軟件分析，結(jié)果：以MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIM

11、P-3與β-actin灰度的比值分別表示其相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果與HG組相比，LG組大隱靜脈MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)雖已明顯減少，但仍高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同樣，其TIMP-2和TIMP-3表達(dá)雖已較HG組明顯增加，但仍與對(duì)照組結(jié)果有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論：糖尿病患者大隱靜脈中的MMP-2、MMP-9和TIMP-2、TIMP-3蛋白表達(dá)情況與其血糖水平相關(guān)，而又不僅僅與血糖水平有關(guān)。同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了基因芯片分析結(jié)果

12、的可靠性。
　　第四部分不同血糖水平對(duì)冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)前大隱靜脈MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3蛋白活性影響的免疫組化法分析
　　目的：采用免疫組化法研究不同血糖水平對(duì)冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)前大隱靜脈MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3蛋白活性的影響。方法：患者分組和大隱靜脈標(biāo)本的獲取同正文第一部分。石蠟切片脫蠟水化后，3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波熱處理修復(fù)抗原，正常小牛血清封閉非特異性抗原，

13、分別滴加MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3的鼠抗人多克隆抗體，孵育過夜后加入生物素化羊抗鼠IgG二抗，孵育30 min后滴加DAB顯色液，常規(guī)脫水、封固。棕褐色為陽性著色，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。切片經(jīng)顯微攝像掃描后，將圖像輸入計(jì)算機(jī)，采用計(jì)算機(jī)圖像分析測(cè)得平均光密度值（OD值），進(jìn)行定量分析。結(jié)果：相比于HG組，LG組大隱靜脈的MMP-2和MMP-9蛋白活性均明顯降低，但仍高于對(duì)照組，且該差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而其TIM