高鹽環(huán)境對(duì)LPS刺激后RPE細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響及其機(jī)制的探討.pdf

1、背景：視網(wǎng)膜色素上皮（RPE），位于視網(wǎng)膜外層，與脈絡(luò)膜相連，由緊密連接的單層細(xì)胞構(gòu)成，具有支持和營養(yǎng)觀感受器細(xì)胞、遮光、散熱以及再生和修復(fù)作用。由RPE自發(fā)產(chǎn)生的細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19，在過去數(shù)十年已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于對(duì)RPE病理生理的研究，包括老年性黃斑病變（AMD）、玻璃體視網(wǎng)膜病變、葡萄膜炎等多種疾病。受各種外界刺激后，ARPE-19細(xì)胞分泌的最主要細(xì)胞因子是白介素6（IL-6）、白介素（IL-8）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）。

2、IL-6被廣泛認(rèn)為是一種促炎細(xì)胞因子，在眼內(nèi)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起到重要作用；IL-8和MCP-1是中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的重要化學(xué)趨化因子，在炎癥性視網(wǎng)膜疾病時(shí)它們能夠使這些細(xì)胞遷移浸潤于眼內(nèi)的組織中。
　　據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，基因和環(huán)境因素都參與了眼內(nèi)炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展。導(dǎo)致眼部疾病的環(huán)境因素的關(guān)注重點(diǎn)主要是感染在自身免疫是性葡萄膜炎發(fā)病和發(fā)展的作用，而對(duì)于日常飲食因素的研究相對(duì)較少。目前研究證據(jù)表明，高鹽飲食可能參與了自

3、身免疫性疾病的病理改變。最近的研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食能夠通過誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的免疫應(yīng)答來加劇小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的嚴(yán)重程度。而高鹽環(huán)境對(duì)Th17細(xì)胞的作用是通過活化了p38/MAPK細(xì)胞通路及其細(xì)胞核內(nèi)的途徑NFAT5、SGK1。病例對(duì)照研究表明高鹽飲食的攝入會(huì)增加吸煙人群罹患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)，并且高鹽攝入與多發(fā)性硬化病人在臨床醫(yī)學(xué)上和放射醫(yī)學(xué)上的疾病活動(dòng)性增加有密切聯(lián)系。高鹽的攝入是否能夠影響葡萄膜炎等眼部自身免疫疾病

4、目前尚不清楚。
　　由于視網(wǎng)膜色素上皮層作為細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)在眼內(nèi)炎癥反應(yīng)中具有重要作用，本課題主要探討高鹽環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮層細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響及其活化的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　目的：高鹽環(huán)境已經(jīng)被證實(shí)能夠通過誘導(dǎo)活化病理性Th17細(xì)胞來加劇自身免疫疾病的病理改變，但在眼部炎癥性疾病尤其是葡萄膜炎等眼部自身免疫性疾病中的影響尚不清楚。本課題探討高鹽環(huán)境對(duì) ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的影響以及可能參與這一反應(yīng)的機(jī)制

5、。
　　方法：ARPE-19細(xì)胞在含有10％血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中生長至成熟融合后用脂多糖（LPS）刺激，并分別加入氯化鈉20mM和40mM。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高鹽對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8），檢測(cè)細(xì)胞增值的變化；通過酶聯(lián)免疫定量吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)DMEM培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8和MCP-1炎性細(xì)胞因子的含量；采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)可能參與高炎所致炎性反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路。

6、
　　結(jié)果：
　?。?）LPS刺激后的RPE細(xì)胞，加入20mM和40mM氯化鈉培養(yǎng),Annexin/PI染色并用流式技術(shù)檢測(cè)，與空白對(duì)照組相比，兩種濃度均不能引起細(xì)胞凋亡的顯著變化。
　?。?）LPS刺激后的RPE細(xì)胞，加入20mM和40mM氯化鈉培養(yǎng)。與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞在刺激24h、48h和72h后的增殖狀態(tài)沒有明顯的差異。
　　（3）LPS刺激后的RPE細(xì)胞，加入20mM和40mM氯化鈉培養(yǎng)24h，收集上

7、清培養(yǎng)液，ELISA檢測(cè)其中的細(xì)胞因子結(jié)果表明：40mM濃度的氯化鈉可對(duì)細(xì)胞IL-6和MCP-1的分泌有明顯促進(jìn)作用，而IL-8沒有顯著變化；20mM氯化鈉僅能使MCP-1的分泌量增加，而對(duì)IL-6和IL-8均沒有顯著影響。
　?。?）LPS刺激后的RPE細(xì)胞，加入80mM甘露醇和40mM氯化鈉培養(yǎng)24h。檢測(cè)上清培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子，結(jié)果表明甘露醇不能引起IL-6、IL-8和MCP-1分泌的明顯變化，而40mM氯化鈉依舊對(duì)IL-6

8、和MCP-1的分泌有顯著的上調(diào)作用，從而排除單純滲透壓對(duì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響。
　?。?）LPS刺激后的RPE細(xì)胞，與20mM和40mM氯化鈉共培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞通路的磷酸化水平。40mM濃度使p38/MAPK、Akt和NF-κB的磷酸化水平顯著升高，而對(duì)JNK和ERK-1/2的磷酸化水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)影響；20mM濃度對(duì)各細(xì)胞通路均不能使其磷酸化水平發(fā)生明顯變化。
　?。?）檢測(cè)p38/MAPK下游的核內(nèi)細(xì)