頸動(dòng)脈支架置入后血管炎性反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化及機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察頸動(dòng)脈支架置入術(shù)后局部炎癥反應(yīng)的炎癥因子及其動(dòng)態(tài)變化，了解MMP-9及其他炎癥因子的變化規(guī)律及作用時(shí)間，為后期藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。觀察機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)THP-1細(xì)胞的激活作用，探討其作為動(dòng)脈支架置入術(shù)后炎癥反應(yīng)的離體模型的可行性。闡明細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2)-轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1(ETS-like-1，ELK-1)通路在機(jī)械

2、損傷的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)THP-1細(xì)胞的激活并產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)過(guò)程中的作用，從而了解可能的炎癥反應(yīng)作用機(jī)制和信號(hào)途徑。探索血管緊張素酶受體抑制劑(angiotensin receptor bloker，ARB)類藥物替米沙坦對(duì)該通路可能的影響，以評(píng)估該類藥物在預(yù)防頸動(dòng)脈支架置入后血管再狹窄和卒中終點(diǎn)事件中的作用和應(yīng)用前景。
　　方法：
　　第一部分：對(duì)行

3、頸動(dòng)脈支架置入術(shù)的患者分別于術(shù)前、術(shù)后24小時(shí)、術(shù)后3個(gè)月、術(shù)后半年進(jìn)行隨訪，采集基本情況、服藥情況、臨床事件、并發(fā)癥的發(fā)生，并采集外周血血清使用ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素Iβ(interleukin-1β，IL-1β)，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)，MMP-9的動(dòng)態(tài)變化，以及采集外周血單核細(xì)胞使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

4、細(xì)胞膜上Toll樣受體-4(Toll like receptor 4，TLR-4)表達(dá)情況。
　　第二部分：正常內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照組，檢測(cè)單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞在不同程度機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清的作用下的對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力。正常內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，在機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清的作用下，transwell體外模型檢測(cè)THP-1細(xì)胞的趨化能力和侵襲能力的變化，免疫熒光檢測(cè)在這一過(guò)程中的ERK1/2的活化

5、及活化部位。
　　第三部分：正常內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照組，western blot檢測(cè)單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞在機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清的作用下的磷酸化的ERK1/2(phosphorylation extracellular regulated kinase1/2，P-ERK1/2)、磷酸化的ELK-1(phosphorylation ETS-like-1，P-ELK-1)及MMP-9的表達(dá)時(shí)間規(guī)律。通過(guò)PD9805

6、9(ERK1/2阻滯劑)對(duì)THP-1阻滯作用，觀察其對(duì)機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞P-ERK1/2、P-ELK-1及MMP-9表達(dá)的影響。噻唑藍(lán)(3-4，5-Dimethylthiazol-2-y1-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法繪制藥物抑制曲線，篩選ARB類藥物替米沙坦作用于THP-1細(xì)胞的最佳濃度。使用替米沙坦孵育THP-1細(xì)胞1小時(shí)后，再更換為機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上

7、清的對(duì)其進(jìn)行刺激，觀察P-ERK1/2、P-ELK-1及MMP-9的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分：共有74名患者納入實(shí)驗(yàn)，男性48人，女性26人，平均年齡為66.15±7.39歲，半年隨訪期內(nèi)患者中發(fā)生短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack，TIA)1例，死亡1例，卒中2例，出血傾向3例，未發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)再狹窄的患者。炎癥因子IL-1β，IL-6，TGF-β，MMP-9在支架置入術(shù)后24小時(shí)

8、均明顯上升(P<0.05)。其中IL-1β，IL-6，TGF-β在術(shù)后3個(gè)月回落至術(shù)前表達(dá)水平，但MMP-9在3個(gè)月時(shí)仍保持高表達(dá)(P<0.05)。TLR-4在術(shù)前術(shù)后表達(dá)變化不明顯(P>0.05)，隨訪顯示，在支架置入術(shù)后3個(gè)月，其表達(dá)變化亦不大(P>0.05)。
　　第二部分：機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清能增強(qiáng)THP-1細(xì)胞的粘附能力，中度損傷組的作用能力最強(qiáng)(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比，THP-1細(xì)胞趨化能力及侵襲能力也

9、得到了增強(qiáng)(P<0.05)。其P-ERK1/2的表達(dá)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，并在作用后15min時(shí)達(dá)到了最強(qiáng)。
　　第三部分：機(jī)械損傷的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生P-ERK1/2、P-ELK-1及MMP-9，其中P-ERK1/2在誘導(dǎo)后15分鐘、P-ELK-1在誘導(dǎo)后15分鐘，MMP-9在誘導(dǎo)后6小時(shí)達(dá)到高峰(P<0.05)。ERK1/2阻滯劑可降低P-ELK-1及MMP-9表達(dá)(P<0.05)。替米沙坦的對(duì)THP-1細(xì)胞

10、作用的最佳濃度為10μ mol/L，其可通過(guò)降低ELK-1的磷酸化從而降低MMP-9的表達(dá)(P<0.05)，而對(duì)ERK1/2的活化影響不大(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.IL-1β，IL-6，TGF-β，MMP-9均在頸動(dòng)脈支架置入術(shù)后的急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，術(shù)后慢性期血管重塑再狹窄可能與MMP-9的高表達(dá)有關(guān)。
　　2.TLR-4是否參與了支架置入術(shù)后的急性期的炎癥反應(yīng)以及慢性期的重塑過(guò)程尚不明確，還需要進(jìn)