Calpains對機械通氣肺損傷早期炎性反應(yīng)的作用及機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 對于呼吸功能嚴(yán)重受損的患者，機械通氣是必不可少的治療手段。然而機械通氣是把雙刃劍，在提供有效呼吸支持的同時，還能導(dǎo)致肺部嚴(yán)重損傷，即機械通氣所致肺損傷(ventilator-induced lung injury VILI)。這是機械通氣最嚴(yán)重的并發(fā)癥，易誘發(fā)炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MSOF)，死亡率近50％。
　　 肺牽張是VILI的主要原因。機械牽張可使氣道上皮屏障功能降低

2、，肺泡毛細血管通透性增強，中性粒細胞遷移浸潤。而機體如何將機械信號轉(zhuǎn)為生物信號并釋放各種致炎因子促進中性粒細胞(PMN)浸潤肺，最終導(dǎo)致SIRS及MSOF，其早期機制仍未知，因此闡明VILI的早期機制，了解起始免疫反應(yīng)，有助于VILI的早期治療，意義重大。
　　 Calpains是存在于細胞漿的Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶（蛋白水解酶），自從1964年由Guroff第一次將Calpain描述為鈣激活的中性蛋白酶，關(guān)于其形態(tài)、結(jié)構(gòu)

3、、活性、位置、生理及病理作用已經(jīng)被越來越多的闡述。到目前，哺乳動物中已被識別的Calpain蛋白酶家族成員有15個，基于其組織表現(xiàn)形式不同分為普遍存在型和組織特異型。其中Calpain1、Calpain2、 Calpain10存在于所有哺乳動物細胞中;Calpain3(肌肉P94)、Calpain8(胃nCL-2)是組織特異表達型。Calpain1和Calpain2是最主要的兩種亞型，它們由兩種不同的催化亞基(80KDa)和一種相同的調(diào)

4、節(jié)亞基(28KDa)組成，兩者的激活分別需要微摩爾和毫摩爾的Ca2+濃度來活化，所以又分別被稱為u-Calpain和m-Calpain。當(dāng)細胞內(nèi)Ca2+濃度超過各亞型所需閾濃度時，其兩種亞基產(chǎn)生催化、自溶反應(yīng)，使其構(gòu)象改變從而產(chǎn)生了活性[1,2]。
　　 目前Calpains的生理作用還未完全闡明，但研究表明Calpains參與了細胞運動、凋亡、炎癥等過程。短暫的Calpains活性參與細胞信號和蛋白逆轉(zhuǎn)錄過程，而持續(xù)的Calp

5、ains活性與急性神經(jīng)系統(tǒng)損傷和阿爾茨海默病有關(guān)。Calpain1基因缺失小鼠將導(dǎo)致血小板功能障礙，Calpain1和Calpain2基因缺失小鼠將導(dǎo)致胚胎死亡。Calpain1調(diào)節(jié)了膿毒血癥中肺血管內(nèi)皮細胞的凋亡，Calpain抑制劑降低了酵母多糖所致的多器官功能衰竭和出血性休克大鼠的多器官損傷和NF-kB活性(3,4,5)。
　　 目前Calpain在VILI的作用及調(diào)節(jié)機理，未見報道。
　　 本研究顯示大潮氣量機械

6、通氣早期即誘發(fā)了迅速的Calapain活性和以中性粒細胞浸潤、肺毛細血管通透性增高、肺水腫形成為特征的炎性反應(yīng);分別以體內(nèi)轉(zhuǎn)染小干擾RNA基因沉默技術(shù)和藥物途徑干預(yù)Calpain表達后，降低了支氣管灌洗液(BAL)內(nèi)中性粒細胞數(shù)和蛋白含量、同時TNF-a、IL-6降低，肺毛細血管外肺水含量(ELW)減少、肺MPO活性降低，說明Calpain在VILI發(fā)病機理中起關(guān)鍵性作用，是機械通氣肺損傷早期炎性反應(yīng)發(fā)病機理的關(guān)鍵因素。進一步的研究顯示

7、，大潮氣量機械通氣誘發(fā)Calpain活性后，介導(dǎo)了NOS-3磷酸化，使NOS-3磷酸化來源的NO產(chǎn)物聚集增多，后者刺激細胞粘附因子ICAM-1磷酸化，使P-ICAM-1蛋白表達增高，刺激PMN浸潤入肺產(chǎn)生VILI。提示由大潮氣量機械通氣刺激Calpain活性增高觸發(fā)的早期肺炎性反應(yīng)是通過Akt_P-NOS3_NO_Src_P-ICAM1_PMN途徑而產(chǎn)生的。
　　 研究方法:
　　 動物實驗。
　　 本研究分四部

8、分
　　 第一部分小鼠機械通氣肺損傷模型的建立及大潮氣量機械通氣肺炎性反應(yīng)
　　 1.小鼠機械通氣肺損傷模型:育齡8-12周、體重25-30克重的雄性C57BL/6J小鼠，以氯胺酮腹腔注射麻醉(75mg/kg)，后行氣管切開，分別以大潮氣量（28ml/kg、呼吸頻率60次/分鐘）和普通潮氣量（7ml/kg、呼吸頻率120次/分鐘）行機械通氣。1％異氟醚與空氣混合維持麻醉。機械通氣維持呼氣末二氧化碳35-45cmH2O、保

9、溫?zé)艟S持體溫37-38。C。(Fig1)
　　 2.大潮氣量機械通氣肺炎性反應(yīng):機械通氣2小時后分別測定支氣管肺泡灌洗液(BAL)內(nèi)的蛋白含量、中性粒細胞數(shù)目、TNF-a、IL-6、肺毛細血管外肺水(ELW)、肺MPO活性測定。每種檢測指標(biāo)需要小鼠6-8只。
　　 第二部分Calpain活性分析及Calpain抑制劑對VILI的作用
　　 1.Calpain活性測定:分別取大潮氣量機械通氣15分鐘、30分鐘、60

10、分鐘、120分鐘肺組織，測定Calpain活性。每組3-4只，數(shù)據(jù)取其平均值。
　　 2.Calpain抑制劑對其活性的影響:Calpain抑制劑I分別以0、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg于機械通氣前1小時行腹腔注射，機械通氣2小時后測定Calpain活性。每組3-4只，數(shù)據(jù)取其平均值。
　　 3.Calpain抑制劑對VILI的作用:Calpain抑制劑10mg/kg使用前后觀察機械通氣對支氣管肺泡灌洗液

11、(BAL)內(nèi)的蛋白含量、中性粒細胞數(shù)目、TNF-a、IL-6、肺毛細血管外肺水（ELW）、肺MPO活性的影響
　　 第三部分脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Calpain1/2siRNA基因模型的建立及Calpain1/2基因knockdown對VILI的作用
　　 1.采用新鮮制備的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法。新鮮制備脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體與Calpain1或Calpain2siRNA以一定比例混勻，于機械通氣前48小時行尾靜脈注射，Calpain

12、scsiRNA相同比例與脂質(zhì)體混合作為對照。Calpain1或Calpain2siRNA是否成功轉(zhuǎn)染由Westem blotting分析驗證。
　　 2.Calpain1/2基因knockdown對VILI的作用:Calpain1/2基因knockdown后對ELW、BAL內(nèi)（蛋白含量、PMN數(shù)目、TNF-a、 IL-6）、肺MPO活性的作用。小鼠分普通潮氣量機械通氣、大潮氣量機械通氣Sc siRNA、Calpain1siRNA

13、、Calpain2siRNA共四組，每組6只，取均值。于機械通氣48小時前行尾靜脈注射Sc siRNA或Calpain1/2siRNA，后行Western blotting分析，確定成功轉(zhuǎn)染的標(biāo)本保留其ELW、BAL內(nèi)（蛋白含量、PMN數(shù)目、TNF-a、 IL-6）、肺MPO活性數(shù)據(jù)，未轉(zhuǎn)染者剔除。
　　 第四部分Calpain對VILI的作用機制
　　 1.Calpain活性對P-ICAM-1、ICAM-I蛋白表達的影

14、響
　　 2.Calpain活性對NO產(chǎn)物的影響
　　 3.NOS抑制劑L-NAME對P-ICAM-1蛋白表達的影響
　　 4.ICAM-1在Tyr518位點磷酸化抑制劑Genistein對P-ICAM-1蛋白表達的影響和對BAL內(nèi)PMN數(shù)目的影響
　　 5.Calpain活性對P-NOS-3、NOS3、NOS2蛋白表達的影響
　　 6.Calpan活性對P-Akt、Akt蛋白表達的影響
　

15、　 結(jié)果:
　　 1與普通潮氣量機械通氣相比，大潮氣量機械通氣2小時產(chǎn)生了以肺泡-毛細血管通透性增強、肺水腫形成、中性粒細胞浸潤入肺為特征的VILI
　　 使ELW增加三倍、BAL的中性粒細胞數(shù)目由正常的幾乎為零上升到8.5*105、BAL的總蛋白含量增加5倍、肺組織MPO活性增加4倍、BAL內(nèi)IL-6、TNF-a由正常的幾乎為零分別上升到110pg/ml和360pg/ml。（Fig2）
　　 2大潮氣量機械通

16、氣產(chǎn)生了迅速的Calpain活性，Calpain抑制劑顯著降低VILI(Fig3、4)
　　 大潮氣量機械通氣15分鐘即引起Calpain活性加倍并維持至2小時，而普通潮氣量機械通氣2小時Calpain活性不變。Calpain抑制劑降低其活性呈劑量依賴性，10mg/kg濃度的抑制劑即可完全阻滯其活性。
　　 Calpain抑制劑減輕了機械通氣肺炎性反應(yīng):提示藥物抑制Calpain活性對減輕VILI有顯著作用。
　　

17、 3 Calpain1或Calpain2基因knockdown降低了VILI(Fig5)
　　 提示以基因沉默技術(shù)干預(yù)Calpain1或Calpain2蛋白表達對減輕VILI有顯著作用。兩種亞型對VILI的作用無顯著差異，提示兩種亞型在VILI中發(fā)揮相同作用
　　 4.1 Calpain活性在VILI中通過調(diào)節(jié)ICAM-1磷酸化發(fā)揮作用(Fig6)
　　 最近的研究顯示:ICAM-1位于絡(luò)氨酸的磷酸化介導(dǎo)了早期

18、炎性反應(yīng)的白細胞的遷移[34,36]。本實驗我們假定大潮氣量機械通氣通過Calpain活性誘發(fā)ICAM-1磷酸化。實驗數(shù)據(jù)顯示大潮氣量機械通氣15分鐘ICAM-1磷酸化開始發(fā)生于Tyr518位點并持續(xù)至機械通氣2小時。Calpain抑制劑顯著降低了機械通氣誘發(fā)的ICAM-1tyrosine的磷酸化;與此相似，Calpain1或Calpain2 knockdown也明顯降低了VILI的ICAM-1磷酸化。Calpain抑制劑或Calpai

19、n1、Calpain2 siRNA本身對ICAM-1磷酸化沒有影響。數(shù)據(jù)還顯示:2小時的機械通氣沒有改變ICAM-1的蛋白表達。
　　 以上結(jié)果顯示Calpain介導(dǎo)了ICAM-1的tyrosine磷酸化。
　　 4.2 Calpain活性介導(dǎo)了NO產(chǎn)物的形成刺激ICAM-1磷酸化從而引起PMN浸潤入肺(Fig7)
　　 體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)肺炎性反應(yīng)中NO來源于NOS-2和NOS-3兩種途徑，NO在VILI的發(fā)病機制中

20、起重要作用。本研究數(shù)據(jù)顯示:與自主呼吸相比，機械通氣15分鐘NO即升高3倍并在2小時的機械通氣中繼續(xù)緩慢升高至4倍，Calpain抑制劑阻滯了這種表現(xiàn)，而Calpain抑制劑本身沒有改變基礎(chǔ)NO濃度;與此相同，Calpain1或Calpain2基因knockdown也顯著抑制了機械通氣NO濃度的升高。
　　 4.3 NO刺激了一系列蛋白的磷酸化(Fig8)
　　 本實驗我們重點判定在小鼠肺內(nèi)，大潮氣量機械通氣誘發(fā)的ICA

21、M-1磷酸化和相應(yīng)的PMN浸潤是否為NO依賴機制。數(shù)據(jù)顯示:非特異性NOS抑制劑L-NAME消除了ICAM-1在Tyr518位點的磷酸化并使BAL內(nèi)PMN顯著降低。
　　 4.4 ICAN-1 tyros ine磷酸化在肺PMN浸潤的作用
　　 我們采用tyrosine特異性抑制劑genistein預(yù)先于機械通氣1小時前腹腔注射，顯著消除了ICAM-1在Tyr518位點的磷酸化并顯著減輕了肺內(nèi)PMN浸潤(Fig8)。

22、r>　　 4.5 Calpain活性上調(diào)了NOS-3磷酸化水平，使NOS-3來源而非NOS-2來源的NO產(chǎn)物增加
　　 實驗數(shù)據(jù)顯示:大潮氣量機械通氣誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO產(chǎn)物來自于NOS-3磷酸化和NOS-2兩種途徑。如圖7所示:機械通氣15分鐘，NOS-3磷酸化提高2.5倍并持續(xù)維持高水平至2小時，NOS-2蛋白表達增高，NOS-3蛋白表達不變;Calpain抑制劑顯著降低NOS-3磷酸化而對NOS-2蛋白表達沒有影響;與此相似，

23、Calpain1或Calpain2基因knockdown后也顯著降低NOS-3磷酸化而對NOS-2蛋白表達沒有影響。這些結(jié)果說明大潮氣量機械通氣時，Calpain通過NOS-3磷酸化途徑而非NOS-2途徑介導(dǎo)NO產(chǎn)物增加(Fig9)。
　　 4.6為了明確Calpain對NOS-3活化（磷酸化）的作用，我們觀察了Calpain對NOS-3上游信號AKt磷酸化的作用
　　 結(jié)果顯示:Akt磷酸化程度在大潮氣量機械通氣的增強

24、是時間依賴性的，機械通氣1小時，達到最高，2小時較1小時下降。Calpain抑制劑或Calpain knockdown后，AKt磷酸化活性也降低。說明Calpain在VILI使NOS-3磷酸化是通過活化其上游信號Akt而產(chǎn)生的(Fig9)。
　　 結(jié)論:
　　 1大潮氣量機械通氣產(chǎn)生了迅速的Calpain活性
　　 2 Calpain活性誘發(fā)了以中性粒細胞浸潤、肺泡-毛細血管通透性增高、肺水腫形成為特征的炎性反應(yīng)

25、;運用脂質(zhì)體介導(dǎo)小干擾RNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因沉默技術(shù)和藥物干預(yù)Calpain表達后，炎性反應(yīng)降低，產(chǎn)生了一系列肺保護作用。
　　 3機械通氣早期Calpain1/2都被激活，兩種亞型在VILI中具有相同作用
　　 4Calpain活性增高介導(dǎo)的早期肺部炎性反應(yīng)是通過Akt-P-NOS3-NO-Src-P-ICAM1-PMN途徑而產(chǎn)生的。(Fig10)
　　 意義:
　　 首次探討Calpain在機械通氣肺損傷