血管緊張素Ⅱ在機(jī)械通氣所致肺損傷中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分機(jī)械通氣所致肺損傷動(dòng)物模型的建立
　　 目的：建立大鼠機(jī)械通氣所致肺損傷(VILI)動(dòng)物模型，研究VILI病理生理改變及其可能的機(jī)制。
　　 方法：40只雄性、健康的SD大鼠，體重在300-350g之間，隨機(jī)均分成A、B、C、D四組，每組各10只。A組為空白對(duì)照組；B組為大潮氣量通氣1h組，潮氣量(VT)＝40 ml/kg；C組為大潮氣量通氣2h組，潮氣量(VT)＝40 ml/kg；D組為大潮氣量通氣4h組，潮氣

2、量(VT)＝40 ml/kg。B、C、D組通氣頻率均為40次/分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后放血處死大鼠。光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)各組肺組織病理改變；RT-PCR檢測(cè)大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(MIP-2)、細(xì)胞粘附分子(ICAM-1)、TNF-a以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞單位p22phox等基因mRNA的表達(dá)水平；EMSA檢測(cè)肺組織細(xì)胞NF-κB的活性，Western Blot檢測(cè)肺細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平；

3、TUNEL法檢測(cè)肺細(xì)胞的凋亡；同時(shí)檢測(cè)肺濕干重比值、MPO、MDA、SOD；檢測(cè)肺灌洗液中總蛋白濃度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的水平。
　　 結(jié)果：(一)A組肺組織無明顯病理改變；B組肺組織病理改變較明顯，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)可見較多的炎性細(xì)胞，肺泡腔可見滲出物；C組肺組織病理改變加重，肺泡間隔增厚，肺泡腔浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞明顯增多，肺泡腔可見較多的滲出物，部分肺泡腔內(nèi)有血性滲出液；D組肺組織病理改變明顯加重，肺泡間隔明顯增厚，

4、肺泡腔中炎性細(xì)胞顯著增多，肺泡腔中可見明顯的血性滲出液。和A組相比，B、C、D組ALI評(píng)分均顯著性增高(P<0.001)；和B組比較，C、D兩組ALI評(píng)分顯著性增高(P<0.01)；和C組比較，D組ALI評(píng)分顯著性增高(P<0.01)。(二)和A組相比，B、C、D組濕干重(W/D)比值、MPO活性、總蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、凋亡指數(shù)(AI)均顯著性升高(P<0.01或0.001)；和B組相比，C、D組上述指標(biāo)顯著性升高(P<0

5、.01或0.001)；和C組相比，D組上述指標(biāo)值顯著性升高(P<0.05或0.01或0.001)。(三)和A組相比，B、C、D組肺組織SOD值均顯著性降低(P<0.05或0.01)；和B組相比，D組肺組織SOD值顯著性降低(P<0.01)，而C組無顯著性差別；和C組比較，D組肺組織SOD值顯著性降低(P<0.05)。和A組比較，B、C、D組肺組織MDA含量顯著性升高(P<0.01)；和B組比較，C組MDA含量無顯著性差別，而D組顯著性升

6、高(P<0.01)；和C組比較，D組肺組織MDA含量顯著性升高(P<0.01)。(四)A組MIP-2、ICAM-1、TNF-a、p22phox mRNA的表達(dá)水平較低，B、C、D組上述基因 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)；和B組比較，C、D組上述基因 mRNA表達(dá)水平顯著性增高(P<0.05或0.001)；和C組相比，D組上述基因 mRNA表達(dá)水平顯著性增高(P<0.05或0.001)。(五)和A組比較，B、C、D組NF-κB

7、的活性顯著性升高(p<0.01)；和B組比較，C、D組NF-κB的活性顯著性升高(p<0.01)；和C組比較，D組NF-κB的活性顯著性升高(p<0.05)。和A組比較，B、C、D組p65蛋白的表達(dá)顯著性升高(p<0.01)；和B組比較，C、D組p65蛋白的表達(dá)顯著性升高(p<0.01)；和C組比較，D組p65蛋白的表達(dá)顯著性升高(p<0.05)。
　　 結(jié)論：大潮氣量機(jī)械通氣產(chǎn)生了明顯的急性肺損傷，表現(xiàn)為滲透性的肺水腫、白細(xì)胞

8、浸潤(rùn)、急性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活以及廣泛的肺細(xì)胞凋亡，其程度隨著通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。
　　 第二部分機(jī)械通氣所致肺損傷與腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活
　　 目的：研究大鼠大潮氣量機(jī)械通氣所致肺損傷(VILI)時(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活。
　　 方法：本研究分成兩部分。(一)24只健康雄性SD大鼠，體重在300-350g之間，隨機(jī)分成B1、B2、B3、B4組(每組6只大鼠)。B1為空白對(duì)照組，不行

9、機(jī)械通氣；B2、B3、B4組分別行大潮氣量機(jī)械通氣(40ml/kg)，通氣時(shí)間分別為1h、2h、4h。(二)24只健康雄性SD大鼠，體重在300-350g之間，隨機(jī)分成C1、C2、C3、C4組(每組6只大鼠)。C1組為空白對(duì)照組，不行機(jī)械通氣；C2、C3、C4組行機(jī)械通氣，潮氣量分別為８ml/kg、20ml/kg、40ml/kg，機(jī)械通氣時(shí)間均為2h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠。光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)各組肺組織病理改變；光鏡下行肺灌洗液中心粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

10、；化學(xué)比色法檢測(cè)肺灌洗液總蛋白和肺組織中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶(MPO)的水平，同時(shí)檢測(cè)肺濕/干比(W/D)值；RT-PCR檢測(cè)大鼠肺組織中血管緊張素原(ANG)、ANG II受體(AT1)以及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)等基因mRNA的表達(dá)水平；Western Blot檢測(cè)肺組織ACE的含量；ELISA法檢測(cè)肺組織并檢測(cè)肺組織中ANG II的含量。
　　 結(jié)果：(一)B1組肺組織無明顯病理改變，B2、B3、B4組出現(xiàn)急性炎性損傷性

11、改變(同第一部分)，且隨著通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加重。C1、C2組肺組織無明顯病理改變，C3組出現(xiàn)急性炎性損傷性改變，C4急性炎性損傷性改變明顯加重。和B1組相比，B2、B3、B4組ALI評(píng)分均顯著性增高(P<0.001)；和B2組比較，B3、B4兩組ALI評(píng)分顯著性增高(P<0.01)；和B3組比較，B4組ALI評(píng)分顯著性增高。和C1、C2組比較，C3、C4兩組ALI評(píng)分顯著性增高(P<0.01)；和C3組比較，C4組ALI評(píng)分顯著性增

12、高(P<0.01)。(二)B1組肺組織肺上皮細(xì)胞AT1受體僅有較弱的表達(dá)(免疫組化)，而B2、B3、B4組肺組織肺上皮細(xì)胞AT1受體表達(dá)顯著性增多(P<0.01)，且隨著通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05或0.01)。C1、C2組肺組織肺上皮細(xì)胞AT1受體僅有較弱的表達(dá)，而C3、C4組AT1受體的表達(dá)水平顯著性升高(P<0.01)；和C3組相比，C4組AT1受體的表達(dá)水平顯著性升高(P<0.01)。
　　 結(jié)論：大潮氣量機(jī)械

13、通氣在產(chǎn)生急性肺損傷(VILI)的同時(shí)，導(dǎo)致RAS系統(tǒng)顯著激活，肺組織血管緊張素II及其受體的表達(dá)顯著增加，這可能是VILI的致病機(jī)制之一。
　　 第三部分血管緊張素II通過激活NF-κB上調(diào)A549細(xì)胞IL-8表達(dá)
　　 目的：研究血管緊張素II對(duì)A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和炎性細(xì)胞因子IL-8的影響。
　　 方法：培養(yǎng)A549細(xì)胞，分別用10-6mmol/L濃度的人重組血管緊張素II刺激A549細(xì)胞0、

14、1、2、4h(按刺激時(shí)間分為D1、D2、D3、D4組)。EMSA檢測(cè)A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，Western Blot檢測(cè)NF-κB p65的水平，RT-PCR檢測(cè)IL-8 mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：血管緊張素II能顯著激活A(yù)549細(xì)胞NF-κB系統(tǒng)并上調(diào)IL-8的表達(dá)，這可能是VILI的致病機(jī)制之一。
　　 第四部分血管緊張素II受體阻斷劑對(duì)VILI的保護(hù)作用
　　 目的：研究血管緊張素I

15、I受體(AT1型)阻斷劑洛沙坦(Losartan)對(duì)機(jī)械通氣所致肺損傷(VILI)的保護(hù)作用。
　　 方法：40只健康SD大鼠，體質(zhì)量300-350g，隨機(jī)均分成a、b、c、d四組，a組空白對(duì)照組，不行機(jī)械通氣；b組為正常潮氣量通氣組：潮氣量(VT)＝10 ml/kg，呼吸頻率(P)＝40次/min；c組為大潮氣量機(jī)械通氣通氣組：潮氣量(VT)＝40ml/kg，呼吸頻率(P)＝40次/min；d組為大潮氣量機(jī)械通氣通氣加Losa

16、rtan處理組：潮氣量(VT)＝40 ml/kg，呼吸頻率(P)＝40次/min，d組大鼠在實(shí)驗(yàn)前30min用Losartan溶液30mg/kg腹腔注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠。檢測(cè)各組肺組織病理改變，RT-PCR檢測(cè)血管緊張素原、AT1受體mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)肺組織血管緊張素II的含量，EMSA、Western Blot檢測(cè)肺組織核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的水平，TUNEL法檢測(cè)肺細(xì)胞的凋亡，化學(xué)比色法檢測(cè)肺組織丙二醛(MDA)的含