水飛薊素在肺缺血再灌注損傷所致肺血管功能障礙中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）是一個(gè)重要的臨床問(wèn)題，也是困擾臨床醫(yī)生多年的難題，通常發(fā)生在肺移植、心肺聯(lián)合移植、肺栓塞的血管再生治療、肺動(dòng)脈成形術(shù)、心肺復(fù)蘇、休克以及各種體外循環(huán)心臟手術(shù)后等多種臨床情況下。近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步與創(chuàng)新，肺移植已經(jīng)逐漸成為治療終末期肺部疾病的有效手段和最終措施。盡管在手術(shù)管理和免疫抑制等方面都取得了一定的進(jìn)展，但肺卻極易受到損傷

2、。肺移植在所有臟器移植中的效果并不理想。研究報(bào)道，肺移植術(shù)后患者一年的生存率僅約為70％，且患者死亡通常發(fā)生在術(shù)后30天以?xún)?nèi)。肺移植手術(shù)受限源于缺血再灌注損傷引起的高比例原發(fā)性移植物功能障礙(primary graft dysfunction，PGD)，主要表現(xiàn)為炎癥瀑布反應(yīng)、肺泡損傷和血管通透性增加。對(duì)于肺移植受者而言，原發(fā)性移植物功能障礙是一種可以導(dǎo)致嚴(yán)重的早期和遠(yuǎn)期后果的并發(fā)癥，因此移植團(tuán)隊(duì)在選擇供體肺方面往往就顯得非常保守。原發(fā)

3、性移植物功能障礙在很大程度上歸因于缺血再灌注損傷，與移植后早期和后期死亡率明顯相關(guān)，嚴(yán)重的原發(fā)性移植物功能障礙（3級(jí)）在肺移植術(shù)后72h內(nèi)的發(fā)生率約為28.8％。另外，原發(fā)性移植物功能障礙也是移植物后期排斥的危險(xiǎn)因素，被認(rèn)為是受者移植后超過(guò)1年死亡的主要原因。肺在經(jīng)歷移植之后必然會(huì)發(fā)生缺血再灌注損傷，引起包括肺血管內(nèi)皮損傷、微循環(huán)障礙以及血液流變學(xué)性質(zhì)改變等在內(nèi)的肺功能受損表現(xiàn)，甚至導(dǎo)致移植的失敗。因此，從肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷發(fā)生的

4、實(shí)際情況來(lái)看，如何在缺血再灌注損傷發(fā)生以前加以干預(yù)或保護(hù)是改善肺移植短期和長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)鍵所在。
　　在肺移植過(guò)程中，缺血和繼發(fā)的再灌注是不可避免的，通常會(huì)導(dǎo)致移植后急性和（或）無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，被稱(chēng)為缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI）。目前，臨床上還沒(méi)有特效的藥物用于防治肺缺血再灌注損傷，而且治療措施僅限于支持治療。肺移植的數(shù)量每年都在增長(zhǎng)，目前的研究方向主要包括:更好地保存供體肺，擴(kuò)大

5、供體肺池，通過(guò)離體肺灌注修復(fù)邊緣供體肺，以及探索預(yù)防或治療肺缺血再灌注損傷的方法。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就已經(jīng)提出了限制肺缺血再灌注損傷的策略，這些策略包括各種抗氧化劑、抗炎藥、間充質(zhì)干細(xì)胞以及氣體分子通氣的應(yīng)用等，使我們對(duì)固有免疫細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮屏障功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制方面有了更進(jìn)一步的理解與認(rèn)識(shí)。最近的研究確定了多種治療策略，包括:①抗氧化策略，使用氧自由基清除劑或氧自由基生成酶抑制劑（如亞甲基藍(lán)或

6、N-乙酰半胱氨酸）;②抗炎策略，使用促炎轉(zhuǎn)錄因子抑制劑（如Egr-1抑制劑）或炎癥介質(zhì)抑制劑（如a1-抗胰蛋白酶、抗細(xì)胞因子或抗HMGB1）;③使用氣體分子通氣（如一氧化碳）或吸入具有抗炎特性的麻醉劑七氟烷;④生長(zhǎng)因子（如角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2）;⑤膳食補(bǔ)充劑，如肌酸;⑥以及基于細(xì)胞的治療策略，如間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用等。此外，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)用diannexin（人膜聯(lián)蛋白V的同型二聚體，具有有效抗凝活性的陰離子磷脂結(jié)合蛋白）處理可通過(guò)減

7、少細(xì)胞死亡和組織炎癥的機(jī)制來(lái)顯著減輕肺移植模型的缺血再灌注損傷。雖然許多實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)描述了各種方法用以預(yù)防或改善缺血再灌注損傷，但這些都還沒(méi)有轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。因此，未來(lái)的研究應(yīng)該旨在更好地理解肺缺血再灌注損傷的機(jī)制以確定更有效的治療靶點(diǎn)，并推動(dòng)最可行的治療方法到臨床試驗(yàn)。
　　水飛薊素是從菊科草本植物水飛薊種子的種皮中提取出來(lái)的活性有效成分，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、維持細(xì)胞膜流動(dòng)性、保護(hù)肝細(xì)胞膜、促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)和再生等作用，是治療各

8、類(lèi)肝臟疾病的傳統(tǒng)藥物。隨著研究的深入，人們還發(fā)現(xiàn)水飛薊素在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)以及對(duì)抗臟器缺血再灌注損傷等方面具有重要作用，其臨床應(yīng)用也更加廣泛。盡管許多研究均表明水飛薊素可以通過(guò)抗炎、抗氧化以及抑制細(xì)胞凋亡等途徑減輕多種臟器的缺血再灌注損傷，但是有關(guān)水飛薊素在肺缺血再灌注損傷所致肺血管功能障礙中的作用及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究擬通過(guò)建立大鼠左肺原位熱缺血再灌注損傷模型，觀察水飛薊素在肺缺血再灌注損傷所致肺

9、血管功能障礙中的作用，并探討其可能機(jī)制。
　　第一部分肺缺血再灌注損傷對(duì)肺血管功能的影響
　　目的:通過(guò)建立大鼠左肺原位熱缺血再灌注損傷模型，觀察肺缺血再灌注損傷對(duì)離體肺動(dòng)脈舒張功能的影響。
　　方法:健康雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組（S組）和缺血再灌注組(IR組)(n=10)。IR組建立大鼠左肺原位熱缺血再灌注損傷模型，阻斷左側(cè)肺門(mén)60min后松開(kāi)結(jié)扎線，形成再灌注;S組大鼠完全按照同樣的外科手術(shù)步驟進(jìn)行操作，

10、只是未做左側(cè)肺門(mén)結(jié)扎。在恢復(fù)血流灌注24h后，放血處死大鼠，取左肺組織備用。在體視顯微鏡下分離左肺二級(jí)肺內(nèi)動(dòng)脈，并將其剪切成長(zhǎng)度約為2.5mm的肺動(dòng)脈環(huán);根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將一部分肺動(dòng)脈環(huán)用人類(lèi)發(fā)絲輕刮動(dòng)脈管腔去除血管內(nèi)皮，制備內(nèi)皮剝除的肺動(dòng)脈環(huán)。采用乙酰膽堿的累積舒張反應(yīng)曲線法分別測(cè)試內(nèi)皮完整和內(nèi)皮剝除離體肺動(dòng)脈環(huán)的舒張功能，以明確內(nèi)皮依賴(lài)性肺動(dòng)脈舒張功能變化;采用硝酸甘油的累積舒張反應(yīng)曲線法分別測(cè)試內(nèi)皮完整和內(nèi)皮剝除離體肺動(dòng)脈環(huán)的舒張功能

11、，以明確非內(nèi)皮依賴(lài)的舒張功能變化。
　　結(jié)果:
　　1.乙酰膽堿誘發(fā)的離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)
　　1.1內(nèi)皮完整時(shí)，S組乙酰膽堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)曲線在1×10-9～1×10-7濃度范圍時(shí)呈緩慢上升趨勢(shì)，當(dāng)累積濃度達(dá)到3×10-7時(shí)，舒張反應(yīng)曲線迅速上升，隨后舒張反應(yīng)曲線的上升趨勢(shì)又趨于平緩，顯示肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能良好;IR組乙酰膽堿誘發(fā)的舒張反應(yīng)曲線總體上升趨勢(shì)較為平緩，顯示肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能降低。與S組比較，IR組乙

12、酰膽堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能顯著降低(P＜0.01)。
　　1.2內(nèi)皮剝除后，S組和IR組乙酰膽堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)曲線雖然均呈緩慢上升趨勢(shì)，但總體卻較為平直，顯示兩組肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能均明顯降低;組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.硝酸甘油誘發(fā)的離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)
　　2.1內(nèi)皮完整時(shí)，S組和IR組硝酸甘油誘發(fā)的肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)曲線在1×10-9～1×10-7濃度范圍時(shí)均呈緩慢上升趨勢(shì)，當(dāng)累積濃度

13、達(dá)到3×10-7時(shí)，舒張反應(yīng)曲線均迅速上升，從1×10-5開(kāi)始舒張反應(yīng)曲線的上升趨勢(shì)又都趨于平緩，顯示兩組肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能良好;組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2內(nèi)皮剝除后，S組和IR組硝酸甘油誘發(fā)的肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)曲線的變化趨勢(shì)與內(nèi)皮完整時(shí)基本一致，顯示兩組肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能良好;組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:肺缺血再灌注損傷可顯著損害內(nèi)皮依賴(lài)性肺動(dòng)脈舒張功能，而不是非內(nèi)皮依賴(lài)性舒

14、張，導(dǎo)致肺動(dòng)脈舒張功能障礙。
　　第二部分水飛薊素在肺缺血再灌注損傷所致肺血管功能障礙中的作用
　　目的:通過(guò)建立大鼠左肺原位熱缺血再灌注損傷模型，觀察水飛薊素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注肺組織炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、caspase-3/9活性、HIF-1α和iNOS蛋白表達(dá)以及肺動(dòng)脈舒張功能障礙的影響，明確水飛薊素在肺缺血再灌注損傷所致肺動(dòng)脈舒張功能障礙中的作用，并探討其潛在機(jī)制。
　　方法:健康雄性SD大鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組（S組

15、）、缺血再灌注組（IR組）和水飛薊素預(yù)處理組（SM組）(n=10)，IR組和SM組的大鼠均按照第一部分中的方法建立左肺原位熱缺血再灌注損傷模型。其中，SM組的大鼠，術(shù)前連續(xù)8天以灌胃的方式給予水飛薊素250mg/kg/d（用生理鹽水稀釋至2ml）;S組和IR組大鼠，用完全相同的方式給予等容量的生理鹽水。在恢復(fù)血流灌注24h后，放血處死大鼠，留取左肺組織標(biāo)本待測(cè)。計(jì)算肺組織濕/干重比值(W/D);采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定肺組織中NF-κB、

16、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量;硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)肺組織中MDA的含量;黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)肺組織中SOD的活性;分光光度法檢測(cè)肺組織中Caspase-9和Caspase-3的活性;Western blotting法檢測(cè)肺組織中HIF-1α和iNOS蛋白的表達(dá);采用乙酰膽堿的累積舒張反應(yīng)曲線法測(cè)試離體肺動(dòng)脈環(huán)的舒張功能變化。
　　結(jié)果:
　　1.三組大鼠肺組織W/D的比較:與S組相比，IR組和SM組肺組織W/D均顯

17、著增加(P＜0.01);與IR組比較，SM組肺組織W/D明顯降低(P＜0.01)。
　　2.三組大鼠肺組織炎性反應(yīng)的比較:與S組相比，IR組和SM組肺組織中NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著增加(P＜0.01);與IR組比較，SM組肺組織中NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β含量明顯降低(P＜0.01)。
　　3.三組大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的比較:與S組相比，IR組和SM組肺組織中MDA含量均明顯

18、增加，SOD活性均顯著降低(P＜0.01);與IR組比較，SM組肺組織中MDA顯著降低，SOD活性明顯增加(P＜0.01)。
　　4.三組大鼠肺組織Caspase-3和Caspase-9活性的比較:與S組比較，IR組和SM組肺組織中Caspase-3和Caspase-9活性均明顯增加(P＜0.01);與IR組比較，SM組肺組織中Caspase-3和Caspase-9活性顯著降低(P＜0.01)。
　　5.三組大鼠肺組織HIF

19、-1α和iNOS蛋白表達(dá)的比較:與S組比較，IR組和SM組肺組織中HIF-1α和iNOS蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.01);與IR組比較，SM組肺組織中HIF-1α和iNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。
　　6.三組大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)的比較:三組大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)乙酰膽堿誘發(fā)的舒張反應(yīng)曲線在1×10-9～1×10-7濃度范圍時(shí)均呈緩慢上升趨勢(shì)，當(dāng)累積濃度達(dá)到3×10-7時(shí)，三組肺動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)曲線均迅速上升，其中S組上升

20、幅度最大、SM組次之、IR組最小，隨后舒張反應(yīng)曲線的上升趨勢(shì)又趨于平緩，顯示S組肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能良好、SM組次之、IR組最差。三組組間比較:與S組比較，IR組和SM組肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能顯著降低(P＜0.01);與IR組相比，SM組肺動(dòng)脈環(huán)舒張功能顯著改善(P＜0.01)。
　　結(jié)論:水飛薊素可顯著改善肺缺血再灌注損傷所致內(nèi)皮依賴(lài)性肺動(dòng)脈舒張功能障礙，其機(jī)制可能與其抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)HIF-1α-iNOS信號(hào)通路有