DDR1-MMP9通路在大鼠腦缺血損傷所致的血腦屏障破壞中的作用和機制研究.pdf

1、背景:
　　卒中(尤其是缺血性腦卒中)仍然是威脅我國國民健康的主要殺手之一,在我國,腦卒中具有高發(fā)病率、高患病率、高致殘率和高死亡率的特點;同時,腦卒中給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和巨額的財政支出[2]。目前,臨床中最主要治療卒中的方式是組織型纖溶酶原激活物(tPA);然而,由于治療時間窗窄[1],使得這唯一有效的治療干預(yù)方式的使用受到了極大的限制。因此,認識卒中發(fā)生的機制并針對性地研究新而有效的干預(yù)措施已是迫在眉睫。
　　血

2、腦屏障(blood brain barrier,BBB)是存在于血液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的一道物理屏障,其主要功能是監(jiān)管出入物質(zhì)的轉(zhuǎn)運,保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受各種內(nèi)外因素的傷害;因此,BBB在維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[3]。然而,血腦屏障的損傷將會導(dǎo)致神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)退行性變以及中樞神經(jīng)功能的障礙。引起血腦屏障破壞的因素很多,包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetallop roteinases,MMPs)、氧化應(yīng)激、血管生成

3、因子、炎性細胞因子、自身抗體、白細胞粘附因子、免疫細胞的浸潤和各種病原體,它們的共同特點是均會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白表達的減少、基底膜的降解和血腦屏障通透性的增加,進而加重腦損傷的程度[4]。
　　MMPs是一組Zn2依賴性內(nèi)肽酶,能夠降解和重塑細胞外基質(zhì)。各種外源性損傷因子或大腦的缺血再灌注損傷均會引起炎性反應(yīng)和氧自由基的增加,這些損傷因子激活MMP9、MMP3等基質(zhì)金屬蛋白酶類后降解BBB的基底膜成分和細胞外基質(zhì),進而

4、引起血腦屏障的破壞;而血腦屏障的破壞又可反過來加重腦損傷程度,導(dǎo)致血管源性腦水腫以及一系列的腦損傷[5]。在MMPs中,基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetallop roteinase-9,MMP-9)與腦梗死程度關(guān)系密切[6]。腦缺血/再灌注損傷后表達上調(diào)的MMP9通過降解基底膜,破壞血腦屏障,加重腦損傷;因此,抑制腦缺血損傷后MMP-9的表達、保護血腦屏障的完整性可能是減輕腦損傷的重要措施。
　　盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(disc

5、oidin domain receptor l,DDR1),屬于圓盤狀的結(jié)構(gòu)域受體酪氨酸激酶類(DDRs),它的主要功能是調(diào)控膠原的合成及降解、酶活性并監(jiān)控細胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)成分的形成;有研究表明,ECM的破壞在腫瘤組織的浸潤和轉(zhuǎn)移中同樣也起著非常關(guān)鍵的作用[7]。以往許多腫瘤研究已證實DDR1可通過與各型膠原(I-V型)的結(jié)合介導(dǎo)MMP9的表達和活性,在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和擴散中起到了非常關(guān)鍵

6、的作用[8,9];但是DDR1和MMP9的關(guān)系在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究較少,而在腦缺血損傷后并未見報道;所以我們通過建立大鼠的MCAO模型來觀察腦缺血再灌注損傷后DDR1的表達改變及其對MMP9的影響和機制,并觀察下調(diào) DDR1的表達水平對血腦屏障通透性的作用,為缺血性腦損傷后血腦屏障的破壞提供一個新的有效的治療手段。
　　實驗一:腦缺血再灌注損傷后DDR1蛋白及其磷酸化水平的表達改變
　　目的:采用大鼠的在體MCAO模型觀察腦

7、缺血及再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平的表達改變情況。
　　方法:健康成年雄性 SD大鼠55只,隨機分為假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(MCAO)、siRNA處理組(siRNA)和siRNA錯配組(siRNA-c)。sham組僅分離血管,不進行線栓阻塞;MCAO組在大腦中動脈阻塞2小時,分別于再灌注3h,6h,12h,24h后1.5倍的正常麻醉劑量下處死大鼠(每個時間點 n=5);siRNA組在MCAO前3天側(cè)腦室轉(zhuǎn)染DDR

8、1-siRNA,于缺血2h再灌注24h后處死大鼠;siRNA-c組在MCAO前3天側(cè)腦室轉(zhuǎn)染DDR1-siRNA-c,于缺血2h再灌注24h后處死大鼠。各組均取同側(cè)缺血半暗帶組織進行Western blotting檢測DDR1及其磷酸化水平的表達改變(n=5);另外,各組于腹腔灌注并固定后連續(xù)冰凍切片,使用DDR1和NeuN的免疫熒光雙標(biāo)來觀察DDR1在神經(jīng)元上的表達改變(n=5)。
　　結(jié)果:與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注損傷后D

9、DR1蛋白的表達及其磷酸化水平伴隨再灌注時間的持續(xù)明顯上調(diào),并于再灌注24h達到高峰;而通過側(cè)腦室注射DDR1的siRNA后,DDR1蛋白的表達及其磷酸化水平相比MCAO組明顯下調(diào),(P<0.01 MCAO vs.sham; P<0.01siRNA vs.MCAO);另外,注射siRNA-c組DDR1的表達同MCAO組相比無明顯改變(P>0.05)。
　　結(jié)論:腦缺血再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平隨著再灌注損傷時間的持續(xù)均有不

10、同程度的升高。
　　實驗二:抑制DDR1的過表達對MMP9表達和活性的影響
　　目的:采用大鼠在體MCAO模型來觀察抑制DDR1的過表達后MMP9的表達水平和酶蛋白活性的改變情況。
　　方法:健康成年雄性SD大鼠35只,體重280~320g,分組和處理方法同實驗一,各組取同側(cè)缺血半暗帶組織進行Western blotting和明膠酶譜分析法檢測MMP9的酶蛋白表達及其酶活性改變。
　　結(jié)果:正常情況下,MMP9的

11、表達和活性極低,腦缺再灌注損傷后MMP9的表達和活性伴隨再灌注時間的持續(xù)明顯上調(diào),并于再灌注24h達到高峰。側(cè)腦室注射siRNA抑制DDR1的表達后,MMP9的表達和活性明顯下調(diào)(P<0.01 MCAO vs.sham;P<0.01siRNA vs.MCAO);注射siRNA-c組MMP9的表達同MCAO組相比無明顯改變(P>0.05)。
　　結(jié)論:DDR1 siRNA可降低腦缺血損傷后缺血半暗帶區(qū)MMP9的表達和酶活性。

12、　　實驗三:下調(diào)DDR1蛋白表達及其磷酸化水平對血腦屏障通透性的影響
　　目的:采用大鼠在體MCAO模型觀察下調(diào)DDR1及其磷酸化的表達對血腦屏障通透性、腦梗死容積和神經(jīng)行為學(xué)的影響。
　　方法:健康成年雄性SD大鼠112只,體重280~320g,分組方法同實驗一。MCAO后,大腦中動脈阻塞2小時,分別于再灌注24h后處死大鼠。采用伊文思藍染色評估血腦屏障的通透性(n=12)、干濕比重法測定腦水含量(n=8)、TTC染色法來

13、評估梗死后的容積百分比(n=8)。
　　結(jié)果:和假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注損傷后,大鼠的血腦屏障通透性(伊文思藍含量:9.464±0.5342μg/g;腦水含量:83.73±0.44％)升高,神經(jīng)行為學(xué)評分(6.250±0.8864)降低,腦梗死容積(44.75±3.778%)增加;與MCAO組相比,siRNA組大鼠的血腦屏障通透性(伊文思藍含量:4.614±1.142μg/g;腦水含量:79.76±1.05%)降低,神經(jīng)行為學(xué)(

14、12.63±1.408)明顯改善,腦梗死容積(22.45±3.018%)明顯減少(P<0.05),（P<0.01 MCAO vs.sham; P<0.01siRNA vs.MCAO)。
　　結(jié)論:抑制DDR1及其磷酸化的過表達可有效減輕血腦屏障通透性增加,減少腦梗死容積,改善神經(jīng)行為學(xué)評分。
　　小結(jié):
　　我們的研究結(jié)果顯示腦缺血再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平明顯上調(diào)、BBB通透性增高、腦梗死容積增大、神經(jīng)行為學(xué)

15、評分降低。抑制 DDR1的過表達可減輕MCAO后BBB的通透性,并可減輕缺血再灌注后的腦損傷。進一步的研究發(fā)現(xiàn),DDR1蛋白可能是通過上調(diào)其下游分子MMP9的表達量及酶活性造成缺血后BBB通透性增高和腦損傷的。本研究為我們提供了一個新的思路即:特異性地抑制DDR1的過表達或許就有可能起到保護血腦屏障、降低缺血性卒中的發(fā)生率的作用。本課題為腦缺血后BBB損傷的研究拓寬了思路,下一步我們將從DDR1調(diào)控MMP9的中間分子機制入手,進一步揭示