我國新生隱球菌的基因分型和分子流行病學分析.pdf

1、本研究通過分子生物學技術(shù)，如PCR 指紋法、PCR 特異擴增、PCR-RFLP、MLST、系統(tǒng)發(fā)育研究來分析我國新生隱球菌臨床分離株的分子特征，旨在闡明我國新生隱球菌基因型和交配型在臨床中的分布及其分子流行病學特征。主要工作包括以下三個部分： 一、PCR-RFLP和PCR 指紋法在新生隱球菌基因分型中的應用與比較 目的：探討針對結(jié)構(gòu)基因g6341的PCR－RFLP 方法在新生隱球菌基因分型中的應用價值，并與PCR 指紋分

2、型法進行比較。方法：以野生型噬菌體M13 中針對小衛(wèi)星DNA的核心序列為單引物，對受試的新生隱球菌進行PCR 指紋分型。選擇結(jié)構(gòu)基因g6341 進行PCRRFLP分析，在序列保守區(qū)設(shè)計通用引物，篩選合適的限制性內(nèi)切酶進行RFLP 分析，并與PCR 指紋法進行比較。G6341 基因擴增片段測序，進行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究各主要基因型間的親緣關(guān)系。結(jié)果：多位點基因序列分析表明，結(jié)構(gòu)基因g6341 可作為RFLP 分析的合適靶點。對76 株新生隱

3、球菌的基因分型結(jié)果顯示，針對g6341的PCR-RFLP 方法與PCR 指紋法結(jié)果一致。分析g6341 基因部分序列得出，8 種主要基因型菌株相互間的同源性在84％～97％之間，同一主要基因型菌株的同源性在99％～100％之間。分子發(fā)育樹中，VNI－VNIV 基因型、VGI－VGIV 基因型分別聚在一類。結(jié)論：針對結(jié)構(gòu)基因g6341的PCR-RFLP 方法可作為新生隱球菌分子分型的有效工具，對g6341 基因的序列分析可揭示不同菌株間的

4、遺傳進化關(guān)系。 二、國內(nèi)110 株新生隱球菌臨床株變種、基因型和交配型分析 目的：對國內(nèi)部分地區(qū)的新生隱球菌臨床株進行分子流行病學調(diào)查，分析其變種、基因型和交配型的構(gòu)成和分布。方法：1、PCR 指紋分型法：以野生型噬菌體M13 中針對小衛(wèi)星DNA的核心序列為單引物對模板進行PCR 擴增，將所有受試菌株鑒定到8 種主要基因型水平。2、利用變種和交配型特異性引物擴增分型法，區(qū)分格魯比、新生和格特變種，同時鑒定α和a 交配型。

5、結(jié)果：110 株臨床株中，98株（89.1％）為格魯比變種，均為VNI 基因型和α交配型；9 株（8.2％）格特變種，包括VGI 基因型、α交配型8 株（7.3％）和VGII基因型、α交配型1 株（0.9％）；2 株（1.8％）為AD 雜合體，VNIII基因型，-/α和α/-交配型各1 株；1 株（0.9％）為新生變種，VNIV基因型和a 交配型。結(jié)論：我國新生隱球菌臨床株包含3 個變種和AD雜合體。與國外情況比較，相似的是國內(nèi)臨床株中

6、絕大部分為α交配型菌株，且格魯比變種中的VNI 基因型占了其中的大部分；但未發(fā)現(xiàn)VN II、VG III和VGIV 基因型菌株。 三、我國致病格特隱球菌的基因亞型分析 目的：分析我國致病格特隱球菌的基因型和基因亞型，探討其與世界范圍內(nèi)格特隱球菌的親緣關(guān)系和分子流行病學聯(lián)系。方法：擴增國內(nèi)9 株格特隱球菌臨床株的3 個非連鎖位點即IGS1（基因內(nèi)間隔區(qū)）、PLB1（磷脂酶編碼基因）和GEF1（交配型位點內(nèi)基因）部分可變區(qū)片

7、段，檢索GenBank 上相應位點的核酸序列信息，進行多位點的序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析；選擇針對MF 基因(編碼性激素）的PCR 特異擴增法鑒定交配型。結(jié)果：1、國內(nèi)8 株VGI 基因型和α交配型菌株在IGS1、PLB1和GEF1 位點上的所測序列與以菌株WM276為代表的一種基因亞型完全相同；國內(nèi)首株VGII 基因型和α交配型菌株在IGS1和PLB1 位點所測序列與以菌株R272 為代表的一種基因亞型一致。2、針對GEF1 基因部分片段