醫(yī)藥衛(wèi)生分子流行病學(xué)概述及我國分子流行病

1、分子流行病學(xué)概述及我國分子流行病學(xué)研究現(xiàn)狀,提綱：一、分子流行病概述 (一)定義 (二)分子流行病學(xué)研究內(nèi)容和范圍 (三)分子流行病學(xué)常用的主要研究方法二、我國分子流行病學(xué)研究現(xiàn)狀 (一)病原體分型和檢測研究 (二)人群中疾病流行規(guī)律、傳播機(jī)理研究 (三)在慢性病研究中的應(yīng)用 (四)在遣傳性疾病研究中的應(yīng)用

2、 (五)在疾病防治方面的應(yīng)用三、存在問題和前景 (一)存在問題 (二)前景,流行病學(xué)是研究人群中疾病和健康的分布，探索影響分布的因素，并在此基礎(chǔ)上制定預(yù)防策略的措施的一門學(xué)科。一直以來，流行病學(xué)在疾病的預(yù)防和治療，疾病危險因素的研究和控制方面都起著十分重要的作用。近二三十年來，生物學(xué)技術(shù)尤其是分子生物學(xué)技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，并逐漸滲透到各個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。分子生物學(xué)的理論和技術(shù)不斷應(yīng)用于傳統(tǒng)的流行病

3、學(xué)，并在此基礎(chǔ)上形成了一門新的分支學(xué)科——分子流行病學(xué)。,一、分子流行病學(xué)概述,（一）定義 分子流行病學(xué)是應(yīng)用先進(jìn)的實驗技術(shù)測量生物學(xué)標(biāo)志，結(jié)合流行病學(xué)現(xiàn)場研究方法，從分子水平闡明疾病的病因及其相關(guān)的致病過程，并提出與評價相應(yīng)防治措施的科學(xué)。這一定義包含了幾個要點：（1）分子流行病學(xué)是流行病學(xué)的一個分支，是傳統(tǒng)流行病學(xué)與新興的生物學(xué)技術(shù)，特別是分子生物學(xué)技術(shù)之間的一門邊緣學(xué)科、交叉學(xué)科；（2）分子流行病學(xué)的主要研究對象是各種生物

4、學(xué)標(biāo)志；（3）與傳統(tǒng)流行病學(xué)不同，分子流行病學(xué)還研究暴露因子引起疾病的相關(guān)過程，以測定各種易感性標(biāo)志，并提出針對性預(yù)防措施，尤其是阻斷暴露因子進(jìn)入體內(nèi)后致病進(jìn)程的初級預(yù)防措施。,,圖1 傳統(tǒng)流行病學(xué)與分子流行病學(xué)的關(guān)系（Schulte，1993）,表1 傳統(tǒng)和分子流行病學(xué)的比較 傳統(tǒng)流行病學(xué) 分子流行病學(xué)推動力 公共衛(wèi)生

5、 現(xiàn)代科學(xué)研究水平 人群 個體/器官組織/細(xì)胞/分子研究樣式 人口統(tǒng)計學(xué)/社會科學(xué) 臨床/實驗認(rèn)識論策略 自上而下 自下而上預(yù)測水平 人群 個體,,,,綜合上

6、述國內(nèi)外學(xué)者的分子流行病學(xué)研究實踐及其對分子流行病學(xué)的理解，提出如下定義：分子流行病學(xué)是應(yīng)用先進(jìn)的實驗技術(shù)測量生物學(xué)標(biāo)志，結(jié)合流行病學(xué)現(xiàn)場研究方法，從分子水平闡明疾病的病因及其相關(guān)的致病過程，并提出與評價相應(yīng)防制措施的科學(xué)。,1．疾病病因的探討 疾病的發(fā)生，大多是環(huán)境因素與遺傳因素同時起作用。只是有些疾病以環(huán)境因素為主，有些則正好相反。遺傳因素起重要作用的疾病往往與基因有關(guān)，這不言而喻；而很多與環(huán)境因素有關(guān)的疾病，

7、也常常需從基因方面去研究，因為環(huán)境因素可以通過宿主的基因突變或異常表達(dá)引起疾病。因此，分子流行病學(xué)研究在這方面起著非常重要的作用。,（二）分子流行病學(xué)研究內(nèi)容和范圍,意大利學(xué)者Dragani在1996年名古屋會議上報告，以前一般認(rèn)為肺癌的家庭聚集性很少見，故基因因素的作用很小。但他從小鼠模型發(fā)現(xiàn)染色體上存在易感或抑制肺癌的基因位點。此后作者在人群中選擇病理確診的肺腺癌125例作為病例組，另在健康供血員人群中隨機(jī)選擇179名作普通人群對照

8、檢測顯示，在KRAS2基因第2外顯子下游有個基因位點與拮抗肺癌產(chǎn)生并延長肺癌患者的生存期有關(guān)。,表2 肺腺癌病人和普通人群對照中KRAS2 Rsal等位基因的基因型頻率,,基因型a,普通人群,肺腺癌,觀察數(shù),期望數(shù)b,,,A1/A1A1/A2A2/A2,966815,8959 4,81.557.812.7,,計,179,152,152,,注：a：等位基因A1為無酶切位點；A2為有酶切位點； b：按

9、普通人群的頻率推算所得； c：卡方檢驗Ρ=0.025。,2．危險因子致病機(jī)制的研究 分子流行病學(xué)不僅研究環(huán)境與宿主體內(nèi)的致病因子，而且著重研究這些致病的危險因素，特別是化學(xué)物質(zhì)與生物活性物質(zhì)從暴露開始至疾病發(fā)生全過程的各個環(huán)節(jié)。,癌癥發(fā)病的分子流行病學(xué)研究是個典型的例子。20多年來，對與癌相關(guān)的各種生物學(xué)標(biāo)志，致癌物的種種生物效應(yīng)標(biāo)志，如DNA加成物（adduct）等等進(jìn)行了十分廣泛的研究，有關(guān)報道

10、相當(dāng)豐富，積累了很多資料，提出了一些很有意義的假設(shè)。目前認(rèn)為，致癌化學(xué)因子進(jìn)入體內(nèi)，最終引起臨床癌癥過程的基本框架大致如下。致癌作用是多階段的，正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞經(jīng)歷了致癌作用累積而又連續(xù)的幾個階段：啟動（initiation）、促進(jìn)（promotion），轉(zhuǎn)化（conversion）和發(fā)展（progression）。在啟動階段，機(jī)體暴露于環(huán)境致癌化學(xué)物質(zhì)，致癌物進(jìn)入體內(nèi)需經(jīng)代謝活化（metabolic activation），變成反

11、應(yīng)性親電物質(zhì)（reactive electrophilic form），再與DNA反應(yīng)形成DNA加成物。在致癌物進(jìn)入體內(nèi)后，這種反應(yīng)通常僅需幾小時就可完成。當(dāng)DNA復(fù)制時，這種對DNA的化學(xué)損傷可引起基因的變化，這些基因的變化如果逃避了DNA修復(fù)作用，就會被固定下來。某些基因損傷可造成癌基因的活化或抑癌基因的失活，從而使正常細(xì)胞變成啟動細(xì)胞。這個過程往往僅需幾天時間。但促進(jìn)過程卻是人類致癌過程中最長的階段，啟動細(xì)胞呈克隆樣擴(kuò)展需10年甚

12、至更長。促進(jìn)階段的細(xì)胞還需經(jīng)過進(jìn)一步的基因改變，并獲得侵襲性與轉(zhuǎn)移的惡性表型，才能進(jìn)入轉(zhuǎn)化與發(fā)展階段，而這后2個階段大概需1~2年的時間。,,圖2 分子流行病學(xué)和癌的發(fā)展過程及其三級預(yù)防策略,3．疾病易感性的測定 個體對疾病都存在一定的感受性，稱之為易感性。以往一般認(rèn)為，只有傳染病才有確定的易感性，可以用測定機(jī)體內(nèi)是否存在某種特異性保護(hù)（中和）抗體的方法了解其對某種傳染病是否具有易感性或免疫力。然而，近來分子生物

13、學(xué)與免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對很多疾病也同樣存在著易感性，且往往與個體的某些基因型別或序列或其表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)，如果與遺傳有聯(lián)系，往往稱之為遺傳易感性（尤其慢性?。?。同時還發(fā)現(xiàn)很多傳染性疾病的易感性，除了與能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的致病微生物有關(guān)外，也和機(jī)體的某些基因類型有聯(lián)系，因為后者決定了機(jī)體對致病微生物的免疫反應(yīng)的方式與強(qiáng)度。,對于常見的慢性疾病的遺傳易感性的分析，可以應(yīng)用同時檢測特異基因標(biāo)志的病例對照研究進(jìn)行。例如，如果某個特異性的等位

14、基因在某病病人中明顯高于對照，這就提示該等位基因的存在可能使機(jī)體對某病具有一定的易感性。目前，與遺傳易感性相關(guān)研究較多的一個基因區(qū)域是人類第6號染色體短臂上的人類白細(xì)胞抗原（HLA），其原因可能有二，首先HLA基因區(qū)有高度的多態(tài)性，其次為HLA的功能是介導(dǎo)對特異性抗原的免疫反應(yīng)。Erlich的研究發(fā)現(xiàn)，HLAⅡ類單倍體（DRB1﹡1501-DQ B1﹡0602）的比例在受到人乳頭瘤狀病毒（HPV）16型感染的宮頸癌與重度異常增生的病人中

15、明顯升高。,4．流行規(guī)律的研究 這方面研究最多的是傳染病。在傳播范圍的確定，傳播途徑的判斷與傳染源的追索方面，分子流行病學(xué)可以發(fā)揮無與倫比的作用。因為以往常常是根據(jù)宏觀流行病學(xué)調(diào)查分析，再輔以病原體分離與血清學(xué)分型來分析流行規(guī)律。然而近年的很多分子流行病學(xué)的研究表明，上述的方法有時不夠精確。例如，盡管傳染源與接觸者之間的病原體的血清學(xué)型別一致，但如果基因型不一致，就不能確切判定兩者的傳播關(guān)系。,（1）傳播范圍的確定

16、 按照傳染病流行病學(xué)基本理論，在一次爆發(fā)或流行中，其受染范圍的確定應(yīng)根據(jù)如下原則：在爆發(fā)或流行期間，有共同或有效暴露史，經(jīng)過一個平均潛伏期發(fā)病或出現(xiàn)急性感染的生物學(xué)標(biāo)志可判定為受染者，然后總計受染人員，結(jié)合這些人員活動的區(qū)域，以確定受染或流行涉及范圍?？墒?，過去測定的生物學(xué)標(biāo)志主要是屬于血清學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)范圍，缺乏基因型標(biāo)志，因而可能出現(xiàn)錯誤的判斷。分子流行病學(xué)研究縮小了常規(guī)流行病學(xué)調(diào)查所推測受染范圍，從基因水平上證實爆發(fā)的受染

17、人數(shù)與傳染來源。,（2）傳播途徑的判定 以往，傳染病流行中傳播途徑或傳播媒介的調(diào)查通常使用排除法，同時盡可能在媒介物中分離到引起流行的病原體或檢測到病原學(xué)標(biāo)志。近來分子流行病學(xué)研究引入一些新的技術(shù)，如分子進(jìn)化診斷（molecular evolutionary diagnosis）。例如，不少分析性流行病學(xué)研究與血清流行病學(xué)研究均認(rèn)為丙肝病毒（HCV）可經(jīng)性傳播途徑感染配偶。然而，出人意料的是，在1993年東京國際病毒性肝炎會議有2篇報

18、道，用分子進(jìn)化法進(jìn)行的研究提出了相反的意見。如Ohno篩檢50對至少有一方抗-HCV陽性的夫婦，發(fā)現(xiàn)僅4對夫婦雙方抗-HCV均陽性。用PCR擴(kuò)增、測序分型，結(jié)果其中2對配偶男女之間的HCV RNA彼此的基因型別不同，由此可排除性傳播所至；另2對夫婦之間型別相同，用分子進(jìn)化診斷判定男女病毒株的分株時間（divergence time），發(fā)現(xiàn)第1對配偶的分株時間發(fā)生在45~52年前，而結(jié)婚卻才32年；第2對配偶分株時間已有30~34年，結(jié)婚

19、時間則在25年前?；谶@些研究結(jié)果，作者認(rèn)為HCV經(jīng)性傳播的可能性很小。,（3）傳染源的追索 判定傳染來源或兩人之間的傳播關(guān)系應(yīng)符合如下4條原則：①A（傳染源）與B（受染者）的接觸是有效接觸（暴露）；②接觸發(fā)生在A的傳染期內(nèi)；③B的發(fā)病時間是在暴露后該病最短與最長潛伏期之間；④A與B受染致病的血清學(xué)型別一致。如今看來，第④條應(yīng)該用基因型別來代替，而基因序列的測定與型別差異的鑒定雖然比較復(fù)雜與精細(xì)，但可靠得多。,美國1990~1991年

20、報道佛羅里達(dá)一個口腔診所有1名患有艾滋病的牙醫(yī)，被他看過病的患者中有7名后來感染了HIV，然而經(jīng)過分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其中5名患者的HIV與牙醫(yī)的HIV有共同的氨基酸特異模式（signature pattern），而且序列的差異率<5.0%，為同一病毒株；而另2名患者的HIV則與牙醫(yī)的不同。因此，通過序列分析，從分子水平確定了前5名病人的HIV感染是由牙醫(yī)引起，而后2名病人的傳染來源則不是牙醫(yī)。,5．防制措施的研究

21、 （1）傳染病預(yù)防 因為在傳染病流行的研究中應(yīng)用了分子生物學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)，對傳播與流行范圍的確定，傳播途徑、傳播媒介與因子以及傳染來源的推斷更為精確，所以提出的控制措施更有針對性，更有成效。 傳染病預(yù)防中最可靠的手段是疫苗接種。已有很多傳染病由于實施了安全、有效、廣泛的免疫接種，發(fā)病率已大幅度地下降。 但少數(shù)疫苗由于某些原因可以使極個別疫苗接種者發(fā)生被免疫的疾病。過去，僅能根據(jù)接種史與分

22、離病原體作血清學(xué)或生化反應(yīng)來進(jìn)行判斷，但可靠性不強(qiáng)。而現(xiàn)在用分子生物學(xué)技術(shù)作基因序列分析可以確實地判定是否為疫苗株引起的發(fā)病。,（2）非傳染病的預(yù)防 由于分子流行病學(xué)不僅研究疾病的危險因素，而且研究其引起疾病整個過程中的所有環(huán)節(jié)，也即研究這些致病因子的致病機(jī)制，因此，這就為疾病的三級預(yù)防特別是第I、II級預(yù)防采取針對性措施奠定了科學(xué)的基礎(chǔ)。在這個意義上也可以說，分子流行病學(xué)的建立，為疾病的三級預(yù)防開辟了十分廣闊的前景。

23、 圖-2以癌癥為例，描繪了應(yīng)用分子流行病學(xué)方法研究致癌因子導(dǎo)致正常細(xì)胞基因改變===選擇性克隆擴(kuò)增====基因改變====細(xì)胞異質(zhì)化====臨床癌癥過程的主要階段，以及針對這些改變所能采取的不同階段的具體預(yù)防與干預(yù)措施：防止暴露、預(yù)防最終致癌因子的形成、阻斷其與宿主基因間的相互作用、抑制癌前起始或啟動細(xì)胞的產(chǎn)生、抑制選擇性克隆的擴(kuò)散、早期診斷、手術(shù)與放射治療、化學(xué)治療；預(yù)防復(fù)發(fā)與繼發(fā)腫瘤。,,圖2 分子流行病學(xué)和癌的發(fā)展過程及

24、其三級預(yù)防策略,分子流行病學(xué)在某種意義上講，是一種流行病學(xué)宏觀與實驗室微觀結(jié)合的方法學(xué)，需要現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查研究與實驗室先進(jìn)的檢測技術(shù)相結(jié)合。因此，分子流行病學(xué)的研究方法大致可以分為二大類：實驗室技術(shù)與流行病學(xué)現(xiàn)場研究方法。,（三）分子流行病學(xué)常用的主要研究方法,1．實驗技術(shù) （1）基因序列分析 通過需測定的基因（靶基因）序列提取，克隆入測序載體或用PCR直接電泳測序。這是測定基因核酸序列及其類型、突變部位與方式的最可靠的

25、方法，在傳染病與非傳染病分子流行病學(xué)研究中都十分常用。但技術(shù)操作比較復(fù)雜，分析也需細(xì)致并具備一定經(jīng)驗，在國內(nèi)，目前還只在一些大學(xué)、研究所、大醫(yī)院等開展，表3常用檢測基因變異方法。,表3 基因變異的檢測和篩查方法比較,注：+ —可用，—不宜用；A—完全確定；B—不完全確定；C—不能確定。,（2）分子進(jìn)化分析（molecular evolutionary analysis） 用核酸序列測定技術(shù)結(jié)合計算機(jī)分析，確定流行中感染的病原株之間的

26、親緣關(guān)系和序列突變時其時間，以研究傳播關(guān)系和病原體的進(jìn)化。所以目前主要用于傳染病的研究。 （3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）分析 其簡要操作步驟與原理為：將被檢的靶基因PCR擴(kuò)增后變性為單鏈核酸，然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察區(qū)帶的遷移率。由于遷移率與核酸的構(gòu)象密切相關(guān)，甚至1個堿基的突變都可以改變構(gòu)象，產(chǎn)生電泳遷移率的差異。因此，藉此可

27、以檢出基因的突變，而不需要測序。SSCP簡便，價格便宜，已被很多學(xué)者應(yīng)用傳染病與非傳染病的研究。國內(nèi)也有些單位在使用，然而由于影響因素多，需要操作技術(shù)熟練，重復(fù)性差，尚未被普遍使用。另外，SSCP不能判斷DNA變異的確切部位與方式，如要作深入研究，還需進(jìn)行序列測定。,（4）基因芯片技術(shù)（DNA chip） 基因芯片是指固定有許多有序列的寡核甘酸探針的載體，通過雜交檢測，對各種基因進(jìn)行分析。由于它所具有的高通量性、快速、敏感、便宜等優(yōu)點

28、，在多個領(lǐng)域起到越來越重要的作用。基因芯片基本原理是通過原位雜交方法，用已知的DNA序列檢測未知序列。目前主要用于DNA突變分析，基因譜差異分析，基因診斷分析和大規(guī)?；蝾愋头治?。其研制技術(shù)主要包括以下幾大步驟：寡核苷酸探針合成、固定、雜交和檢測。,2．現(xiàn)場分子流行病學(xué)研究方法 傳統(tǒng)的現(xiàn)場流行病學(xué)研究方法，即描述性研究，分析性研究與干預(yù)性研究均可應(yīng)用于分子流行病學(xué)。也可以說，在傳統(tǒng)的流行病學(xué)研究中，結(jié)合檢測一些生物學(xué)標(biāo)

29、志，以從分子水平更深層次揭示病因聯(lián)系或致病因子的致病機(jī)制。目前較常用有2種。,（1）巢式（套式、嵌入式）病例對照研究（nested case control study） 運(yùn)作開始是按隊列研究的方式進(jìn)行：選擇一隊列，收集基線資料，采集所需研究的生物學(xué)標(biāo)志的組織或體液標(biāo)本儲存?zhèn)溆?，然后隨訪到出現(xiàn)能滿足病例對照研究樣本量的病例數(shù)為止。把這些病例作為病例組，按配比條件，從同一隊列中選擇1或數(shù)個非病例作對照，抽出病例與對照的基線資料并檢測收集

30、的標(biāo)本，資料按配比病例對照研究處理，其他的非病例及其資料，標(biāo)本均可不用。由于此種研究是按隊列研究設(shè)計進(jìn)行，資料收集和生物標(biāo)本采集均在發(fā)病前，觀察的又是生物學(xué)標(biāo)志，故因果關(guān)系清楚，資料可靠，論證強(qiáng)度高；而標(biāo)本檢測與資料處理又按病例對照研究方法，故省錢省時省力，可以說兼有隊列研究與病例對照研究兩者之優(yōu)點。,（2）病例-病例研究（case-case study） 在病例對照研究的病例組中，臨床類型可以不同，如腦卒中有出血型、缺血型，冠心病有

31、心梗型、無心梗型；某些生物學(xué)標(biāo)志往往也是不均一的，即部分病例有某種生物學(xué)標(biāo)志，而其余的則沒有。那么就可把不同的臨床類型或具有標(biāo)志的這些病例與無標(biāo)志的病例，按病例對照研究的方式處理資料，以探討不同臨床類型的危險因素的差異或者這個生物學(xué)標(biāo)志與該疾病的其他危險因素之間的關(guān)系和相互作用。這就能比普通病例對照研究提供更多的信息與線索。在病例對照研究的基礎(chǔ)上再作如此處理，可達(dá)到事半功倍之效?；蛘呤褂脝渭儾±?病例研究可免除選擇對照，特別是免除從無病

32、對照中采取生物標(biāo)本的麻煩與困難。如食管癌的病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，130例食管癌患者中，用免疫組化檢測到p53基因表達(dá)異常的有68例，按病例-病例研究處理，無論是單因素或Logistic回歸分析，均顯示吸煙、食管癌家庭史與p53基因表達(dá)異常有關(guān)，OR值分別為2.3~3.2和2.8~3.8；吸煙還有劑量效應(yīng)，表明吸煙與食管癌家族史很可能是食管癌p53基因異常表達(dá)的危險因素。,二、我國分子流行病學(xué)研究現(xiàn)狀,國內(nèi)自1985年始，將分子生物學(xué)技術(shù)和

33、方法：DNA雜交、基因酶切圖譜分析、序列分析（DNA、AAA）和PCR等技術(shù)應(yīng)用于流行病學(xué)中疾病診斷以及追蹤傳染源的調(diào)查研究。使疾病早期快速、可靠的基因診斷提供了手段，而且使基因分離、克隆表達(dá)與序列分析等技術(shù)更加簡便、高效。另一方面由于流行病學(xué)研究的深入，一些傳統(tǒng)的表型（Phenotype）檢測方法。如染色、形態(tài)、培養(yǎng)特征、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗等已不能完全滿足疾病的病因與傳播途徑精確判別的需要，也不能完全適應(yīng)一些非傳染性疾病病因及制病制

34、理的探討。因此，在短短的十幾年中，國內(nèi)分子流行病學(xué)經(jīng)歷了由產(chǎn)生到起步發(fā)展的過程，并取得重大發(fā)展。,（一）病原體分型和檢測研究 分子流行病學(xué)研究最早開始用于傳染病的病原體基因分型，并調(diào)查病原體的分布規(guī)律。在傳染流行中，對病原體進(jìn)行準(zhǔn)確的分型，對疾病的防治十分重要。由于病原體表型特征的不穩(wěn)定性和易變性，以表型特征研究的分型方法，如血清學(xué)、生化學(xué)等，就存在缺陷。而基因型是遺傳特征，相當(dāng)穩(wěn)定可靠，可以作為病原體鑒定和診斷的重要依據(jù)。細(xì)菌的產(chǎn)毒

35、、耐藥特性都與細(xì)菌質(zhì)粒有關(guān)，徐兆煒等（1986年）對在同一地區(qū)分離的134株痢疾桿菌進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析，發(fā)現(xiàn)雖然部分菌株耐藥譜不同，但仍可呈現(xiàn)為相同的質(zhì)粒圖譜，這對鑒定菌株，追蹤耐藥菌株來源極有幫助。rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA的DNA序列，屬保守基因序列。徐文斌等（1996年）對不同地區(qū)、不同時間分離到的119株傷寒沙門氏菌進(jìn)行rRNA(RTs)的基因多態(tài)性分析，119株細(xì)菌可分為38個RTs，其中RT9和RT11是造成我國傷

36、寒流行的主要RTs。對于病毒的分型，可以采取先進(jìn)行病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，病毒增殖到一定程度后，提取病毒DNA，再進(jìn)行限制性內(nèi)切圖譜分析。,PCR技術(shù)的出現(xiàn)，使對病原體分析過程更加簡化、快捷。首先設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增病原體DNA中一段保守的基因片段，然后進(jìn)行酶切分析。例如，蘇虹等（1997年）利用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析安徽HCV基因型的分布，結(jié)果表明，安徽HCV感染以II型為主，其中北部地區(qū)I

37、II型感染多于南部，而II型北部少于南部。對病原體的基因型、多態(tài)性、變異型可以應(yīng)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、脈沖場電泳（PFGE）以及序列分析等多種方法進(jìn)行分析。,基因的多態(tài)性也表現(xiàn)為酶分子的多態(tài)性，對酶分子的多態(tài)性的研究，也可了解不同病原體間遺傳關(guān)系、分類分型。段廣才等（1996年）應(yīng)用多位點酶電泳法（MEE）對471株霍亂弧菌進(jìn)行分類，結(jié)果證實古典型和埃爾托型流行株遺傳關(guān)系緊密；非流行株相互間流行關(guān)系較遠(yuǎn)。O139群與O1群流行株

38、有相同的霍亂毒素（CT）片段，應(yīng)按流行株對待。 對病原體的檢測，以往多使用病原體培養(yǎng)、生化分析、血清學(xué)和免疫學(xué)檢測等，上述方法都存在各種缺陷，如檢測時間長、靈敏度、特異度不高等。利用放射性同位素標(biāo)記探針檢測病原體，是一種靈敏、特異的檢測方法。除用同位素標(biāo)記探針外，更多的使用非同位素如地高辛、生物素等標(biāo)記探針，增加了安全性。核酸分子雜交方法檢測病原體，在流行病學(xué)研究中應(yīng)用日益增多。王云飛等（1994年）對不同基

39、因型人乳頭瘤病毒（HPV）在宮頸癌、尖銳濕疣等中起不同作用進(jìn)行了研究，證明HPV 11/6型引起性傳播的尖銳濕疣；而HPV16/18型則與宮頸癌關(guān)系密切，HPV52/58型與宮頸關(guān)系還有待證實。,PCR不僅可以用基因分型、克隆和序列分析，還可用于檢測病原體。郭恒彬等（2002年）以構(gòu)建的Rt外膜主要蛋白56kDa型特異抗原（tsa56kDa）基因編碼區(qū)的群、型特異引物，采用1步法PCR分別對Gilliam，Karp，Kato，Kawas

40、aki和Kuroki 5株標(biāo)準(zhǔn)株Rt，江蘇地區(qū)5份Rt陽性標(biāo)本，斑點熱和莫氏立次體以及5份正常輸血員全血標(biāo)本進(jìn)行檢測和分型。研究結(jié)果證明所構(gòu)建的Rt群、型引物具有Rt的特異性，型特異引物在Rt的型與型之間無交叉擴(kuò)增。因此，該研究對恙蟲病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及Rt的型別鑒定具有實用價值。 2003年全國SARS爆發(fā)流行，用分子流行病研究其病尤為必要。如SARS在廣東流行可分三個階段：早期由病人分離到的SARS病

41、毒與果子貍分到的SARS病毒只差27個堿基對，因此懷疑SARS是一種動物來源的??；中期SARS病毒分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，病毒傳播力強(qiáng)，超級傳播事件發(fā)生多；后期SARS病毒堿基短缺可達(dá)幾百個，病毒的傳播力大大減少。,2004年4月蘇北某鎮(zhèn)在學(xué)齡兒童中爆發(fā)一種病。疾癥狀以發(fā)熱，上感和扁桃體腫大為主。病人雖發(fā)熱39℃，但還能騎自行車外出，無肺部征象。到6月份，全鎮(zhèn)共發(fā)生783例。少數(shù)病例培養(yǎng)出鏈球菌，用各種抗菌素后未能控制。5月11日全鎮(zhèn)停課，但病例

42、未能減少，6月1日重新上課。6月4日藥費(fèi)了20萬元，用阿奇霉素口服預(yù)防。隨著病情漸緩，疾病有向周邊擴(kuò)散趨勢。針對這一原因不明疾病，我們首先對20例病人進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)，20例中14例有細(xì)胞病變（70%），經(jīng)診斷是一種腺病毒感染（其中半數(shù)以上熒光抗體和PCR陽性）。再進(jìn)行序列測定證明為腺病毒3型的一次流行。,（二）人群中疾病流行規(guī)律、傳播機(jī)制研究 目前疾病在人群中流行的現(xiàn)象比以往更加復(fù)雜，已由三環(huán)節(jié)二因素向三要素，甚至四要素發(fā)展。病因已由

43、單病因、單效應(yīng)，向多病因、單效應(yīng)，甚至多病因、多效應(yīng)發(fā)展。傳播機(jī)制也由水平傳播、垂直傳播（母嬰傳播）到混合傳播。疾病侵入人體途徑亦日益復(fù)雜。疾病中隱性病例與顯性病例的比例不斷上升，非典型和隱性感染者越來越多。傳染病的潛伏期和非傳染病的潛隱期也越來越長了，而發(fā)病的頻率則越來越低。因此，使用傳統(tǒng)的檢測方法，調(diào)查傳染源、傳播途徑，確定疾病流行規(guī)律，就往往存在一定的困難。,解決上述困難的主要途徑之一是發(fā)展分子流行病學(xué)。使檢測手段更加先進(jìn)、敏感度

44、和特異度更高。HBV的垂直傳播一直是人們關(guān)注的問題，既往的有關(guān)研究，都缺乏直接的證據(jù)，證明垂直傳播的存在。唐時幸等（1991年）使用核酸分子雜交法，從胎兒胎盤組織中檢測到HBV DNA，說明HBV可通過胎盤屏障感染胎兒，而且調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，母親HBV DNA陽性，胎兒宮內(nèi)感染的機(jī)會大大增加。HBV可以通過母親傳染給胎兒，還可能由父親傳染給后代。王培林等（1998年）對乙型肝炎患者家系進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，比較男性患者病前所生子女HBV DN

45、A U5樣序列片段檢出率及HBsAg、HBeAg和抗-HBc陽性率，都顯著低于男性患者病后所生子女，提示HBV可能通過HBV DNA整合的精子，使后代感染HBV。,分析病原體，分離鑒定其亞型，對于追蹤傳染源和傳播途徑，采取相應(yīng)的預(yù)防措施，有重要意義。2003年陰寧等對中國經(jīng)血傳播人群中艾滋病病毒-1與丙型肝炎病毒亞型分布研究中，以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag的p17區(qū)和env的C2V3區(qū)，HCV5ˊNCR區(qū)和E1/E

46、2區(qū)，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。采用ClustalW軟件對所得序列進(jìn)行基因樹分析。結(jié)果共檢測了239例HIV-1感染者，其中HCV陽性率為56.9%（136/239）。在136例HIV-1/HCV混合感染者中，93.6%是通過靜脈吸毒（IVDU）和不潔獻(xiàn)血途徑而感染的。其中HCV基因型為1b、3a、3b和4型。而不潔（輸）獻(xiàn)血人群的HIV-1主要為B型，其HCV基因型以1b和2a為主。,（三）在慢性病研究中的應(yīng)用 隨著生活水平的提高，以及

47、疫苗的廣泛使用，傳染病的發(fā)病率和死亡率逐漸降低，而心血管病、腫瘤等慢性疾病的發(fā)病率和死亡率在不斷上升，成為威脅人類健康的主要疾病。因此，對慢性病的病因研究有重要意義。,1腫瘤 （1）癌變是一個復(fù)雜的多階段過程 癌變過程的復(fù)雜性和對致癌因素反應(yīng)的個體間差異，是腫瘤分子流行病學(xué)的兩條基本原理，兩者的相互作用構(gòu)成了癌變的復(fù)雜多階段過程。 癌變的復(fù)雜性體現(xiàn)在它是一個多因素、多基

48、因和多途徑的過程，癌變過程的中心生物學(xué)事件是癌基因的活化和抑癌基因的失活，引起這些改變的除DNA序列變化外，目前認(rèn)為表遺傳學(xué)改變（epigenetic，指僅影響基因的活性，而不改變基因的結(jié)構(gòu)，如DNA甲基化程度等，產(chǎn)生可遺傳的表型的改變）也起重要的作用。以往認(rèn)為，癌變按啟動、促進(jìn)和演進(jìn)的三個階段的發(fā)生模式，從目前大腸癌等完成的研究結(jié)果看來，這個模式有些簡單化，實際上癌相關(guān)基因的改變發(fā)生在癌變的每一階段，它促進(jìn)了具有生存優(yōu)勢克隆的選擇性擴(kuò)

49、增和細(xì)胞惡性程度的提高。在不同類型的癌，甚至同一種癌的獨(dú)立起源癌灶間，所發(fā)生遺傳學(xué)改變的關(guān)鍵基因種類、數(shù)目和順序都可能是不同的。這些提示，可能存在多種基因功能異常的途徑導(dǎo)致腫瘤的形成。,（2）生物標(biāo)記 分子流行病學(xué)應(yīng)用經(jīng)驗證與人癌變過程相關(guān)，存在于細(xì)胞、組織和體液中的生物標(biāo)記（biomarker），鑒定癌的危險因素，評價個體腫瘤易感性，從暴露人群篩選高危個體和亞群，檢出臨床前早期生物學(xué)反應(yīng)和形態(tài)學(xué)改變，為早期的預(yù)防和干預(yù)提供

50、了機(jī)會。因此生物標(biāo)記的研究在分子流行病學(xué)研究中起著重要的作用。生物標(biāo)記通常分為三類：①暴露生物標(biāo)記：包括內(nèi)部劑量如體液中致癌物或其代謝產(chǎn)物的濃度，以及效應(yīng)劑量如DNA加合物；②效應(yīng)生物標(biāo)記：包括早期生物學(xué)改變?nèi)缛旧w畸變、微核和基因突變等，以及與癌變相關(guān)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的變化等；③易感性生物標(biāo)記：包括癌相關(guān)基因的多態(tài)性等。目前研究較深入的三個代表標(biāo)記均與遺傳學(xué)相關(guān)。,①DNA加合物 致癌劑殘基與DNA共價結(jié)合形成的加合物，提供了特殊致

51、癌劑暴露和原始DNA損傷的證據(jù)，并反映了外源性致癌劑暴露、吸收、代謝和DNA修復(fù)等相關(guān)易感性因素互相作用后的綜合效應(yīng)，其中PAH-DNA和AFB1-DNA加合物被成功地用來證明PAH和AFB1分別為肺癌和肝癌的重要危險因素或病因之一。 ②突變譜 突變譜是指經(jīng)誘變劑作用后，基因內(nèi)突變體的分布情況，主要是由突變熱點所決定。p53抑癌基因在細(xì)胞的正常功能調(diào)控和癌變過程中起重要作用，是研究突變譜的理想候選基因,大量研究表明: p

52、53基因內(nèi)的錯義突變是非隨機(jī)分布，在不同類型的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了突變熱點。熱點的產(chǎn)生是由于特定密碼子對特殊致癌因子的易誘變性，或是某種突變細(xì)胞的選擇生長優(yōu)勢和克隆擴(kuò)增的結(jié)果。若一種致癌因子誘發(fā)的腫瘤總產(chǎn)生同樣的突變譜，則支持該因子起病因作用。致癌因子暴露與癌癥間的分子聯(lián)系最好的例證是肝癌、皮膚癌和肺癌的p53基因的突變譜（表4）。另一方面，內(nèi)源性機(jī)制產(chǎn)生的突變譜則不同于因暴露誘發(fā)的突變譜，例如，在大腸癌發(fā)現(xiàn)2/3以上的突變是C/T堿基轉(zhuǎn)換

53、。,表4 致癌因素暴露、p53基因突變和癌,,暴露,癌的類型,P53突變,食物中的AFB1U．V．煙草煙霧,肝細(xì)胞肝癌皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌肺癌,G-T或G-C顛換，特別是密碼子249在二聚體位置的C-T轉(zhuǎn)換G-T顛換，特別是密碼子157、248、273,,,③ 遺傳多態(tài)性 遺傳多態(tài)性或變體是指在一個群體中，特定位點上經(jīng)常同時出現(xiàn)兩個或兩個以上的等位基因，其中最低的等位基因頻率遠(yuǎn)超過基因突變頻率。遺傳多態(tài)性的分子基礎(chǔ)是DN

54、A序列的變異性，其中約90%為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。積累的大量研究資料表明，代謝酶、DNA修復(fù)蛋白和受體等的基因的多態(tài)性，決定了腫瘤等疾病的易感性、藥物的反應(yīng)性和疾病臨床表現(xiàn)在不同人群和個體間的差異。由于這些等位基因在人群中常見，故在腫瘤等疾病防治中意義重大。近有消息，國際學(xué)術(shù)界和公司協(xié)作繪制人類基因組變異圖譜，這將使發(fā)病和預(yù)防機(jī)制的研究進(jìn)入分子水平。,2．心血管疾病 心血管疾病包括高血壓、冠心病和動脈粥樣硬

55、化等，其病因可能與多種因素，如飲食、緊張焦慮、遺傳等有關(guān)。而分子流行病學(xué)則進(jìn)一步從基因水平對其病因進(jìn)行研究。脂蛋白脂酶（LPL）能促進(jìn)乳糜微粒和極低密度脂蛋白中甘油三酯（TG）分解，如果LPL活性降低，TG含量增高，高密度脂蛋白膽固醇（HDLL）降低，導(dǎo)致冠心病的產(chǎn)生。錢衛(wèi)沖等（1998年）對106例冠心病病例的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，LPL PVU II（--）基因型和單倍體基因型H+P-是冠心病的危險因素，HDL-C和APO A/B是保護(hù)

56、因素，LPL PVU II（--）基因型與非LPL PVU II（--）基因型的OR值是17.18。H+P-基因型與非H+P-基因型OR值為3.67。 除腫瘤和心血管疾病外，分子流行病學(xué)還更廣泛研究其他慢性疾病，如糖尿病、自身免疫疾病等疾病的病因、高危人群的篩選及早期診斷等。,（四）在遺傳性疾病研究中的應(yīng)用 分子流行病學(xué)在非傳染病研究中闡明遺傳易感性方面發(fā)揮了極大的作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因（ACE）位于染色體17q23，

57、包括26個外顯子和25個內(nèi)含子，16內(nèi)含子中的一段287bp的插入/缺失（I/D）多態(tài)性，導(dǎo)致3種基因型：插入純合子型（II）、缺失純合子型（DD）和雜合子型（ID）。ACE基因缺失型與冠心病、心肌梗死等發(fā)病顯著相關(guān)。沈丹等（1998年）研究ACE基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，高血壓合并腦梗死的DD基因型頻率29.6%及D等位基因頻率56.8%，都顯著高于正常組12.8%和46%，ACE基因缺失型可能是造成中國人高血壓合并腦梗死發(fā)病的重要遺傳易感因素

58、。遺傳易感因素的研究，為篩選高危人群提供了線索。,還有一些單基因遺傳性疾病更需要從群體遺傳學(xué)角度研究，其發(fā)病機(jī)理是單個基因或1對等位基因缺陷或發(fā)生突變所引起的，如果能從群體角度研究其遺傳規(guī)律，將有重要意義。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是單基因遺傳病，是由于位于13q14的Rb基因的突變或失活所致，目前公認(rèn)生殖細(xì)胞起源的Rb基因的突變決定了患者發(fā)生視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的遺傳易感性。黃倩等（1998年）檢測79個有Rb基因突變的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤家系中，25例查出

59、體細(xì)胞起源的Rb基因突變，其余54例為生殖細(xì)胞起源的Rb基因突變，其中36例突變是新生的，15例突變由親代遺傳，3例為基因突變嵌合體。,（五）在疾病防治方面的應(yīng)用 進(jìn)行疫苗的預(yù)防接種，是保護(hù)易感人群最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法。使用滅活或減毒活疫苗，存在免疫原性差、毒力回復(fù)，疫苗需冷凍或冷藏等缺點。利用分子生物學(xué)技術(shù)，將DNA重組，構(gòu)建載體，利用細(xì)菌等表達(dá)大量的蛋白質(zhì)作為疫苗，如目前廣泛應(yīng)用的乙型肝炎（乙肝）疫苗，就是將乙肝表面抗原基因連接到

60、適當(dāng)?shù)妮d體上，然后在酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)而得到，通過基因工程生產(chǎn)的乙肝疫苗成本大大低于血源性乙肝疫苗。利用基因工程生產(chǎn)其他疫苗，痢疾、霍亂、瘧疾等亦受到人們關(guān)注?；蚬こ桃呙绲陌踩暂^滅活或減毒活疫苗提高，但由于基因疫苗大多為高度純化的小分子蛋白質(zhì)或多肽，免疫原性差，免疫效果有時不理想。核酸疫苗是第三代預(yù)防接種用疫苗，該種疫苗是在質(zhì)粒DNA上攜帶編碼特定抗原蛋白的基因序列，通過皮內(nèi)或肌肉注射方式，進(jìn)入體內(nèi)。核酸疫苗無需復(fù)雜的純化過程

61、，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，無需冷凍或冷藏，是有廣闊應(yīng)用前景的疫苗。有關(guān)核酸疫苗目前大多在動物中進(jìn)行，經(jīng)過安全、有效檢驗后，有望進(jìn)行臨床試驗。,三、存 在問題和前景,（一）存在問題 1．分子流行病學(xué)亦存在流行病學(xué)的許多局限性，例如，因易受干涉或混雜因素的影響，可能產(chǎn)生誤導(dǎo)的結(jié)果。 2．和任何類型的生物監(jiān)測和篩查一樣，都具有潛在的社會傷害。目前采用的許多生物標(biāo)記雖可用來評估

62、暴露、劑量和對被檢人群的潛在危險性，但不足以預(yù)測疾病，定量估計個體危險性，即使在研究較多的家庭性癌綜合征，遺傳學(xué)檢測已成為臨床處理的一部分，但作為常規(guī)的篩查和診斷還不能推薦，這是因為①即使癌高風(fēng)險易感基因攜帶者，也因基因間及與宿主和環(huán)境因素間的相互作用，使個體危險性難以很好的確定；②對大部分家庭性遺傳性疾病，目前還缺少確切有效的干預(yù)或治療措施；③應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)化的測試技術(shù)、質(zhì)量控制和監(jiān)管。目前這方面尚不成熟；④測試前后應(yīng)有恰當(dāng)?shù)倪z傳咨詢；⑤應(yīng)

63、重視遺傳學(xué)診斷的社會后果，在沒有得到社會普遍理解前，這種檢測除會給癌高危個體造成終生的精神壓力外，還可能給就業(yè)、人壽保險和正常生活帶來種種困擾，故應(yīng)權(quán)衡利弊。當(dāng)然，積極進(jìn)行研究，作好檢測前后的遺傳咨詢和對結(jié)果的保密，不斷提高檢測、干預(yù)和治療的水平，解除這一部分疾病（癌）高危人群的身心痛苦，還是十分緊迫和重要的任務(wù)。,3．較常見的易感基因多態(tài)性，多僅適用于某些特殊的暴露或某種類型的疾病，而且這方面的研究常出現(xiàn)矛盾的結(jié)果，如代謝酶遺傳多態(tài)性

64、對癌危險性的影響就是如此，可能原因是：①研究設(shè)計、方法標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)處理不夠合理；②不同研究樣本種族構(gòu)成和地理環(huán)境條件不同，這些易感基因的頻率、環(huán)境致癌因子的種類和量各不相同，它們相互作用后產(chǎn)生的危險性就更不同；③研究樣本量較小或易感基因型個體過少，影響統(tǒng)計效力；④基因多態(tài)性對癌易感性僅有中低程度的影響；⑤不同研究條件下混雜因素的影響等。,（二）前景 為促進(jìn)分子流行病學(xué)、基因組流行病學(xué)研究的迅速而健康地發(fā)展，應(yīng)克服上述存在問題和

65、把握基因組學(xué)研究的新成果，重點要抓?。孩偌訌?qiáng)基礎(chǔ)、流行病學(xué)和醫(yī)學(xué)專家之間協(xié)作，取長補(bǔ)短，做好科研設(shè)計，提高實驗質(zhì)量和結(jié)果分析水平；②應(yīng)用人類基因組研究的新成果和生物芯片等新技術(shù)，發(fā)現(xiàn)和驗證與疾病易感性相關(guān)的更多遺傳多態(tài)，并開展蛋白質(zhì)多態(tài)研究，深入研究它們之間及其與環(huán)境之間的交互作用，并闡明在個體疾病易感性中的作用；③我國學(xué)者應(yīng)根據(jù)國情，對高發(fā)或呈上升趨勢的腫瘤、心血管疾病、糖尿病等，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)，有重點地開展大規(guī)模前瞻性