隱球菌基因型與藥物敏感性及快速診斷的相關(guān)研究.pdf

1、選題背景:
　　 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，多種分子生物學(xué)技術(shù)如PCR指紋分型，擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，核糖體rDNA序列分析，多位點(diǎn)序列分型等相繼用于隱球菌的分子流行病學(xué)及遺傳多態(tài)性研究，極大地促進(jìn)了人類對(duì)新生隱球菌遺傳多態(tài)性的認(rèn)識(shí)，增強(qiáng)了尋找致病線索的信心。通過分子生物學(xué)基因分型的方法了解各地流行的隱球菌基因型，對(duì)明確隱球菌的發(fā)病機(jī)制及流行趨勢(shì)有著深遠(yuǎn)的意義。
　　 采用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)分析方法對(duì)臨床隱球菌

2、感染患者體液中分離出的菌株進(jìn)行基因分型，有助于了解我國臨床隱球菌的分子流行病學(xué)特征并監(jiān)測(cè)各基因型的變遷情況。結(jié)合隱球菌臨床分離株對(duì)常見抗真菌藥物的敏感性和臨床患者的臨床表現(xiàn)、治療效果及預(yù)后，以揭示基因型、體外藥敏實(shí)驗(yàn)和臨床治療之間的關(guān)聯(lián)。本課題分析了61株隱球菌臨床分離株的基因型和對(duì)兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶的體外藥物敏感性，分析了基因型和體外藥敏的關(guān)聯(lián)。
　　 另外，如何更早更準(zhǔn)確的明確隱球菌病的診斷對(duì)于臨床早期開

3、展抗真菌治療和改善臨床預(yù)后至今仍是目前臨床診療亟需解決的眾多問題之一，本課題還嘗試結(jié)合隱球菌特異性基因和目前已有的分子技術(shù)方法中，尋求新的更快速的診斷方法。
　　 研究目的:
　　 1.分析1993-2009年分離自我國臨床感染患者的61株隱球菌的基因型組成;
　　 2.觀察61株隱球菌臨床株對(duì)兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的體外藥物敏感性;
　　 3.分析不同種屬、不同基因型的隱球菌對(duì)藥物敏感性

4、的差異;
　　 4.基于隱球菌H99的IGS1基因序列，結(jié)合LAMP技術(shù)，快速特異的診斷隱球菌感染。
　　 研究方法:
　　 1.多位點(diǎn)基因序列分析及基因分型
　　 多位點(diǎn)基因序列分析:對(duì)61株隱球菌臨床株的IGS1和CAP59基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序、序列分析;將各隱球菌臨床株鑒定至基因亞型。
　　 2.觀察隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物的敏感性
　　 用美國CLSI的M27A2微量稀釋法

5、對(duì)61株隱球菌臨床株進(jìn)行常見抗真菌藥物兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的藥敏實(shí)驗(yàn)。
　　 3.比較不同基因型的隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物敏感性的差異
　　 4，構(gòu)建新的快速、特異、敏感的方法以檢測(cè)隱球菌
　　 基于新生隱球菌H99的IGS1序列，利用LAMP（環(huán)等溫介導(dǎo)擴(kuò)增）方法，通過檢測(cè)隱球菌不同基因型的菌株和其他常見真菌驗(yàn)證其特異性，根據(jù)可檢測(cè)出的最小DNA濃度判斷其敏感性。
　　 結(jié)果:

6、r>　　 1.多位點(diǎn)基因序列分析及基因分型
　　 分離自臨床感染患者的61株隱球菌臨床株中，45株(73.77％)為VNⅠ基因型菌株;5株(8.20％)為VNⅡ基因型菌株;2株(3.28％)為VNⅢ基因型菌株;;14株(14.75％)為VGⅠ基因型。
　　 IGS1基因結(jié)合CAP59基因序列分析可以明確的將各臨床株鑒定至基因型水平。
　　 2.觀察隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物的敏感性
　　 61株隱球菌

7、臨床分離株對(duì)兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶均敏感，最小抑菌濃度范圍分別為0.0625～1μg/ml，0.313-4μg/ml，0.125～16μg/ml0.125～8μg/ml,MIC90分別為1μg/ml,0.25μ g/ml,4μ g/ml,4μ g/ml。
　　 3.不同基因型的隱球菌臨床株對(duì)常見抗真菌藥物敏感性的差異
　　 (1)47株從非HIV感染患者體液中分離得到的菌株對(duì)氟康唑的MIC濃度為0.125

8、-4μ g/Ml，其幾何平均數(shù)為1.1589μ g/Ml;而14株來自HIV感染患者的臨床分離株對(duì)氟康唑MIC濃度為0.5-16μ g/Ml，其幾何平均值為3.1228μ g/Ml;其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。
　　 (2)47株從非HIV感染患者體液中分離得到的菌株對(duì)氟胞嘧啶的MIC濃度為0.125-4μ g/Ml，其幾何平均數(shù)為1.4038μ g/Ml;而14株來自HIV感染患者的臨床分離株對(duì)氟康唑MIC濃度為0

9、.5-8μ g/Ml，其幾何平均值為2.9720μ g/Ml;其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　 (3)新生隱球菌對(duì)兩性霉素B，伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的MIC濃度分別為0.0625-1μ g/Ml，0.313-4μ g/Ml，0.125-16μ g/Ml.0.125-8μ g/Ml。格特隱球菌對(duì)這四種抗真菌藥物 MIC濃度為0.125-1μ g/Ml，0.0313-0.5μ g/Ml，0.5-4μ g/Ml，0.

10、5-4μ g/Ml。從種間差異分析，新生隱球菌和格特隱球菌對(duì)于這四種抗真菌藥物的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (4)從基因型分類角度，基因型VNⅠ對(duì)兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶MIC幾何平均值分別為0.5156μ g/Ml，0.1122μ g/Ml，1.3608μ g/Ml，1.6371μ g/Ml;而基因型VGⅠ則分別為0.6300μ g/Ml，0.1072μ g/Ml，1.8517μ g/Ml，1.8517μ g/

11、Ml。這兩種基因型的隱球菌對(duì)兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的MIC均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于在基因型VNⅠ的菌株中有部分菌株來自于HIV感染陽性的患者，為了盡可能減少干擾因素，我們將基因型VNⅠ菌株中來自于HIV感染患者的菌株去除后，再次與基因型VGⅠ菌株分別就兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶再次做Student's比較，結(jié)果依然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4，構(gòu)建新的快速、特異、敏感的方法以檢測(cè)隱球菌
　　 基于IG

12、S1序列設(shè)計(jì)的引物在LAMP反應(yīng)體系具有良好的特異性，除了新生隱球菌和格特隱球菌八個(gè)基因型出現(xiàn)陽性結(jié)果外，其他菌株包括勞倫特隱球菌、淺白隱球菌、淺黃隱球菌、土生隱球菌、指甲隱球菌、瘦弱隱球菌、斯金納隱球菌、念珠菌屬中的白念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、毛孢子菌等均未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。
　　 基于新生隱球菌H99的核糖體內(nèi)基因間隔區(qū)IGS序列的LAMP敏感程度可以達(dá)到0.002fg（即10-6ng）。

13、>　　 結(jié)論:
　　 1.分離自我國臨床患者的隱球菌臨床株以VNⅠ基因型菌株為主;分離自AIDS患者的臨床株亦以VNⅠ基因型菌株為主，2.我國的隱球菌臨床株絕大部分對(duì)常見抗真菌藥兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶均敏感，存在個(gè)別菌株對(duì)兩性霉素B的敏感性下降，可能與臨床上治療接觸該藥有關(guān)系，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究探討;3隱球菌各基因型對(duì)這四種抗真菌藥物的體外藥敏無顯著差異;4，來源于HIV陰性患者的臨床株比來源HIV陽性的菌