PPP1R26-AS1調(diào)控單核細(xì)胞抗新生隱球菌免疫應(yīng)答及其疾病機制研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 篩選并鑒定單核細(xì)胞抗新生隱球菌免疫應(yīng)答中關(guān)鍵性差異長鏈非編碼RNA
　　本部分將篩選在單核細(xì)胞抗新生隱球菌免疫應(yīng)答中差異性表達(dá)的長鏈非編碼RNA(LncRNA)。通過密度梯度離心法分離健康人外周血單個核細(xì)胞，通過CD14磁珠分選試劑盒分離單核細(xì)胞。用熱滅活新生隱球菌刺激單核細(xì)胞12hr后，收集RNA，通過去核糖體二代測序技術(shù)篩選并鑒定其中關(guān)鍵性差異基因的表達(dá)譜，并用實時熒光定量PCR

2、驗證關(guān)鍵性LncRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未刺激組相比，刺激組一共存在893個上調(diào)表達(dá)基因和349個下調(diào)表達(dá)基因;采用Gene Ontology分析，其中701個基因?qū)儆贐iological Process，698個基因?qū)儆贛olecular Function，751個基因?qū)儆贑ellular Component。與未刺激組相比，用熱滅活新生隱球菌刺激組中LncRNAPPP1R26-AS1表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。納入在上海長海

3、醫(yī)院和上海長征醫(yī)院確診為新生隱球菌病患者(n=20)和同期入院體檢人員作為健康對照(n=20)，分離單個核細(xì)胞，經(jīng)實時熒光定量PCR檢測PPP1R26-AS1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與健康對照組相比，新生隱球菌病患者外周血單個核細(xì)胞中PPP1R26-AS1表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，且與患者疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。本部分結(jié)果提示PPP1R26-AS1可能通過影響患者單核細(xì)胞抗新生隱球菌免疫應(yīng)答而參與發(fā)病機制。
　　第二部分 PPP1R2

4、6-AS1負(fù)向調(diào)節(jié)熱滅活新生隱球菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞促炎因子的產(chǎn)生
　　本部分將探討PPP1R26-AS1在單核細(xì)胞抗新生隱球菌免疫應(yīng)答中的作用。構(gòu)建PPP1R26-AS1過表達(dá)腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染入健康人原代單核細(xì)胞。通過AgilentWhole Human Genome Oligo Microarray檢測系統(tǒng)對ADV-PPP1 R26-AS1、ADV-NC、BLANK組mRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析后，篩選其中與免疫相關(guān)信號通路有關(guān)的關(guān)鍵分

5、子并用實時熒光定量PCR進(jìn)行驗證;進(jìn)一步在新生隱球菌病患者和健康對照組外周血單個核細(xì)胞中檢測相關(guān)分子的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ADV-PPP1R26-AS1組中IL-1B和CCL3水平明顯下降(P＜0.05)。與健康對照組相比，新生隱球菌病患者血清中IL-1B蛋白水平明顯下降(P＜0.05)，但CCL3差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本部分結(jié)果提示PPP1R26-AS1可以抑制新生隱球菌誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IL-1B的產(chǎn)生。
　　第三部分

6、 PPP1R26-AS1通過TLR2負(fù)向調(diào)節(jié)熱滅活新生隱球菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-1B的產(chǎn)生
　　本部分將探討PPP1R26-AS1對新生隱球菌誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IL-1B產(chǎn)生的調(diào)控機制。采用實時熒光定量PCR檢測過表達(dá)PPP1R26-AS1對熱滅活新生隱球菌誘導(dǎo)的健康人原代單核細(xì)胞Toll樣受體相關(guān)分子的表達(dá)。采用實時熒光定量PCR及western blot檢測新生隱球菌病患者與健康對照組外周血單個核細(xì)胞中TLR2信號通路分子的水平。利

7、用TLR2功能獲得與缺失實驗，檢測熱滅活隱球菌誘導(dǎo)后單核細(xì)胞IL-1B的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ADV-PPP1R26-AS1組TLR2表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。與健康對照組相比，TLR2、MyD88和TRAF6在新生隱球菌病患者中的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。拮抗健康人原代單核細(xì)胞TLR2后，熱滅活新生隱球菌誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IL-1B表達(dá)被部分抑制;TLR2激動劑可以部分抵消PPP1R26-AS1對熱滅活新生隱球菌誘導(dǎo)的單核