免疫復(fù)合物對人血管內(nèi)皮細胞和單核細胞的活化作用及其機制研究.pdf

1、第一部分
　　 免疫復(fù)合物對人血管內(nèi)皮細胞的活化作用及其機制研究
　　 背景:
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以免疫復(fù)合物(immune complexes，ICs)形成為特征的慢性自身免疫性疾病，其中有文獻報道免疫復(fù)合物包括核酸，核酸相關(guān)蛋白和相應(yīng)的自身抗體三種成分。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中，自然凋亡的細胞不能被單核巨噬細胞清除，結(jié)果導(dǎo)致了這些

2、凋亡細胞的二次凋亡壞死，自身抗原成分核酸和核酸相關(guān)蛋白就從這些二次凋亡細胞的細胞核中釋放出來，然后便產(chǎn)生了針對這些核自身抗原成分的相應(yīng)的自身抗體，例如抗雙鏈DNA抗體，導(dǎo)致了免疫復(fù)合物的形成。免疫復(fù)合物沉積在患者的靶器官如皮膚和腎臟中，導(dǎo)致了這些器官的炎癥和損傷。
　　 血管病變和血管炎，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的典型的并發(fā)癥，有報道稱其發(fā)生在10％至40％的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，多見于患者的皮膚血管，腎小球，冠狀動脈和腦血管。有文獻報道

3、系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管病變和血管炎與免疫復(fù)合物沉積，內(nèi)皮細胞活化以及炎癥細胞的浸潤有關(guān)。然而，免疫復(fù)合物對血管內(nèi)皮細胞的作用及其機制尚不明確。
　　 高遷移率族蛋白1（high-mobility group box1 protein，HMGB1），也叫做兩性霉素，屬于核酸相關(guān)蛋白，是免疫復(fù)合物中的一種重要成分。它幾乎在所有的真核細胞中表達，主要位于細胞核中，在細胞核中，它與核酸成分結(jié)合穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)，并且誘導(dǎo)DNA彎曲來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。

4、在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，HMGB1-核酸復(fù)合物從二次凋亡的細胞核中釋放出來，與相應(yīng)的自身抗體形成免疫復(fù)合物，在血漿中被檢測到顯著升高。在靶器官例如皮膚和腎臟中，包含HMGB1的免疫復(fù)合物大量沉積，導(dǎo)致了靶器官的慢性炎癥和組織損傷。HMGB1的促炎癥活性主要由其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(the receptor for advanced glycationend products，RAGE)來介導(dǎo)。RAGE是一種跨膜蛋白，是免疫球蛋白超

5、家族的成員，在HMGB1介導(dǎo)的信號通路中，它是一個主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。RAGE主要在血管內(nèi)皮細胞，單核和巨噬細胞的細胞膜上表達，能夠經(jīng)過經(jīng)典的信號激活途徑來激活轉(zhuǎn)錄因子NF-λB家族成員p65，而且可以通過激活p65來調(diào)節(jié)自身的表達。
　　 了解了HMGB1是免疫復(fù)合物的重要成分，并且HMGB1的促炎癥活性主要由其受體RAGE來承載。那么，HMGB1-RAGE細胞信號途徑有可能在免疫復(fù)合物對內(nèi)皮細胞的作用中發(fā)揮重要的作用。然而目

6、前為止，這一作用尚沒有文獻報道。因而，評價HMGB1-RAGE細胞信號通路在免疫復(fù)合物對內(nèi)皮細胞的作用中發(fā)揮的作用來探討HMGB1-RAGE細胞信號通路是不是免疫復(fù)合物對內(nèi)皮細胞的作用中的一種可能的機制將會很有意義和價值。
　　 HMGB1的作用能被HMGB1 A-box特異性的阻斷，RAGE能被可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)阻斷。HMGB1 A-box，sRAGE，Bay117082以及這些阻斷劑的組合

7、分別被用來阻斷HMGB1-RAGE細胞信號途徑上的免疫復(fù)合物中HMGB成分，內(nèi)皮細胞表面的RAGE受體，內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65以及它們的組合來檢測免疫復(fù)合物對內(nèi)皮細胞作用的發(fā)生是不是通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑。有報道稱p38細胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和細胞外信號相關(guān)激酶1/2(extracellular signal-related ki

8、nases1 and2，ERK1/2)信號途徑位于RAGE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的通路上，在本研究中，p38 MAPK和ERK1/2的特異性阻斷劑SB203580和PD98059分別用來阻斷p38 MAPK和ERK1/2，以評價這兩個細胞信號途徑在免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞細胞因子分泌反應(yīng)中所發(fā)揮的作用。
　　 目的:
　　 探索免疫復(fù)合物對人血管內(nèi)皮細胞的作用，評價HMGB1-RAGE細胞信號通路在免疫復(fù)合物對

9、人血管內(nèi)皮細胞活化中所發(fā)揮的作用，來探討人系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管炎中免疫復(fù)合物對血管內(nèi)皮細胞的活化作用及其其中一種可能的機制。
　　 方法:
　　 1.在免疫復(fù)合物刺激和阻斷劑阻斷實驗中，把人臍靜脈內(nèi)皮細胞株CRL-1730細胞接種到直徑為6 cm的細胞培養(yǎng)皿中，在細胞達到80％單層細胞融合的時候，對細胞分組并且加藥干預(yù)。先分別加入阻斷劑HMGB1 A-box(10μg/ml)，sRAGE(20μg/ml)，SB203580

10、(10μM)，PD98059(25μM)，Bay117082(1μM)或者它們的組合干預(yù)1小時，然后加入免疫復(fù)合物。孵育2小時后，NF-κB家族成員p65在細胞核中的水平的變化分別用免疫熒光，免疫組化和Western Blot的方法來檢測。孵育6小時后，基因RAGE，ICAM-1，VCAM-1，IL-8，MCP-1，IL-6，TNF-α和IL-1β mRNA水平的變化用熒光實時定量PCR的方法來檢測。孵育16小時后，細胞表面蛋白RAGE

11、，ICAM-1，VCAM-1表達水平的變化用免疫熒光，免疫組化，流式以及細胞ELISA的方法來檢測分析。孵育24小時后，細胞上清液中細胞因子IL-8，MCP-1，IL-6，TNF-α和IL-1β濃度的變化用ELISA的方法來檢測。
　　 2.在單核細胞跨血管內(nèi)皮細胞遷移的實驗中，先把人臍靜脈內(nèi)皮細胞株CRL-1730細胞接種在明膠包被的具有通透性的Transwell小室的濾膜上，形成一單血管內(nèi)皮細胞層后，對該層血管內(nèi)皮細胞分組并

12、且用方法1中描述的方法用阻斷劑和免疫復(fù)合物進行干預(yù)24小時。然后將單核細胞加入到上室中進行跨血管內(nèi)皮細胞遷移，20小時后，將遷移至下室的單核細胞收集起來用細胞計數(shù)儀計數(shù)，并且比較不同干預(yù)組之間單核細胞跨內(nèi)皮細胞遷移的差異。
　　 3.在細胞活性測定實驗中，把人臍靜脈內(nèi)皮細胞株CRL-1730以每孔105個細胞的密度接種到24孔板中，孵育過夜至細胞貼壁融合。將細胞分組，然后分別加入HMGB1 A-box(10μg/ml), sRA

13、GE(20μg/ml), SB203580(10μM), PD98059(25μM)，Bay117082(1μM)或者它們的組合進行干預(yù)。24小時后，將細胞收集起來，用細胞計數(shù)儀計數(shù)不同干預(yù)組細胞總數(shù)的變化，用臺盼藍染色的方法計數(shù)活細胞數(shù)目的差異，并且用CCK-8的方法檢測細胞活性的差異。
　　 4.實驗中，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤來表示。不同實驗組之間的差異用單因素方差分析進行分析，兩組數(shù)

14、據(jù)之間的比較用t檢驗進行分析，P值＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫復(fù)合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路上調(diào)人血管內(nèi)皮細胞表面RAGE受體的表達。
　　 2.免疫復(fù)合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路上調(diào)人血管內(nèi)皮細胞表面粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達。
　　 3.免疫復(fù)合物通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑增加了人血管內(nèi)皮細胞趨化因子IL-8，MCP-1

15、和促炎癥細胞因子IL-6，TNF-α的分泌。
　　 4.p38 MAPK和ERK1/2信號途徑在免疫復(fù)合物通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細胞活化中發(fā)揮重要作用。
　　 5.免疫復(fù)合物通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑導(dǎo)致了人血管內(nèi)皮細胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的活化。
　　 6.免疫復(fù)合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路增強了單核細胞的跨血管內(nèi)皮細胞遷移。
　　 7.HMGB

16、1-RAGE細胞信號途徑上的阻斷劑HMGB1-A-box，sRAGE，Bay117082，SB203580，PD98059以及它們的組合本身對人血管內(nèi)皮細胞沒有細胞毒性作用。
　　 結(jié)論:
　　 本研究證明免疫復(fù)合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路引發(fā)了人血管內(nèi)皮細胞的促炎癥反應(yīng)，而且導(dǎo)致了血管內(nèi)皮細胞功能的變化。這為免疫復(fù)合物對人血管內(nèi)皮細胞的活化作用及其其中一種潛在的機制提供了證明，在理解系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管炎的發(fā)

17、病機制中發(fā)揮重要的作用，并且為將來系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管炎的治療提供了有力的證據(jù)。
　　 第二部分
　　 免疫復(fù)合物對人單核細胞的活化作用及其機制和治療方法研究
　　 背景:
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以免疫復(fù)合物(immune complexes，ICs)形成為特征的慢性自身免疫性疾病，其中有文獻報道免疫復(fù)合物包括核酸，核酸相關(guān)蛋白和相應(yīng)的

18、自身抗體三種成分。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，自然凋亡的細胞不能被單核巨噬細胞清除，結(jié)果導(dǎo)致了這些凋亡細胞的二次凋亡壞死，自身抗原成分核酸和核酸相關(guān)蛋白就從這些二次凋亡細胞的細胞核中釋放出來。然后，針對這些核自身抗原成分的相應(yīng)的自身抗體，例如抗雙鏈DNA抗體便產(chǎn)生了，導(dǎo)致了免疫復(fù)合物的形成。免疫復(fù)合物沉積在人體的靶器官如皮膚和腎臟中，導(dǎo)致了這些器官的炎癥和損傷。
　　 有文獻報道系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的單核細胞異常活化，并且通過產(chǎn)生一系

19、列的細胞因子和功能異常來啟動和維持自身免疫反應(yīng)。其中，IL-6，TNF-α和MCP-1是由單核細胞產(chǎn)生的，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的單核細胞中異常地表達升高，并且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用的細胞因子。單核細胞是人外周血中IL-6的主要來源，IL-6在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中促進B細胞分化成為產(chǎn)生自身抗體的漿細胞，并且促進自身抗體的產(chǎn)生。TNF-α是一個重要的促炎癥因子，它的過表達導(dǎo)致了炎癥的持續(xù)。MCP-1是一種作用非常強的單核細胞

20、趨化蛋白，它促使單核細胞聚集在炎癥發(fā)生的部位。最近對狼瘡腎炎的研究表明，異?；罨膯魏司奘杉毎诶钳從I炎中大量浸潤，促進了狼瘡腎炎的炎癥和損傷，并且影響狼瘡腎炎的最終結(jié)果。
　　 包含核酸，核酸相關(guān)蛋白和相應(yīng)自身抗體三種成分的免疫復(fù)合物是具有致病性的。有文獻報道，從系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者提取的免疫復(fù)合物中的核酸成分與從凋亡細胞中釋放的染色質(zhì)片段的大小差不多，這些片段含有豐富的寡聚核苷酸A類CpG，可以特異性的被表達于單核細胞，類漿細

21、胞樣樹突狀細胞和B細胞上的模式識別受體TLR9識別。TLR9的活化可以被其拮抗劑抑制性的寡聚脫氧核苷酸ODN2088特異性的阻斷。HMGB1，高遷移率族蛋白1，也叫做兩性霉素，屬于免疫復(fù)合物中的核酸相關(guān)蛋白成分，是免疫復(fù)合物中另外一個重要的成分。它表達于幾乎所有的有核細胞，并且主要位于細胞的細胞核中。在細胞核中，它與核苷酸結(jié)合來穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)，并且誘導(dǎo)DNA彎曲來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，HMGB1從二次凋亡的細胞核中釋放出來

22、，并且在血漿中被檢測到顯著升高。一旦釋放到細胞外的環(huán)境中，HMGB1就作為一種炎癥刺激因子，刺激炎癥細胞進一步產(chǎn)生更多的細胞因子。HMGB1的促炎癥作用主要通過與其細胞表面受體RAGE來發(fā)生。RAGE是第一個確定的HMGB1的受體，主要表達在單核細胞，血管平滑肌細胞，內(nèi)皮細胞等細胞的表面，可被可溶性RAGE阻斷。有文獻報道免疫復(fù)合物能活化類漿細胞樣樹突狀細胞和自身反應(yīng)性B細胞來誘導(dǎo)IFN-α和其它促炎癥因子的產(chǎn)生，促進疾病的發(fā)展，通過免

23、疫復(fù)合物中的核酸和HMGB1成分活化細胞受體TLR9和RAGE。然而，免疫復(fù)合物對單核細胞的作用及其潛在的機制尚不明確。
　　 細胞表面受體RAGE和細胞漿受體TLR9都能夠通過經(jīng)典的活化途徑活化NF-κB家族成員p65，p65能調(diào)節(jié)IL-6，TNF-α和MCP-1的表達。另外，RAGE受體被激活后，通過信號通路活化NF-κB家族成員p65，p65還能調(diào)節(jié)RAGE自身的表達。在本研究中，免疫復(fù)合物被用來檢測其對單核細胞的作用，可

24、溶性RAGE，ODN2088和Bay117082被用來分別阻斷RAGE受體，TLR9和NF-κB p65來檢測免疫復(fù)合物對單核細胞作用的可能的機制。
　　 雖然近來在抗炎癥治療方面有所進展，但是當前對系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療的選擇還存在很多分歧和不確定。前面已有研究報道過氧化物酶體增值物受體γ(PPAR-γ)激動劑在系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中是一種很有效的治療方法。它能夠減少自身抗體的產(chǎn)生，而且能夠減少腎臟炎癥和損傷。研究報道，PPAR

25、-γ激動劑包括噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZDs)，前列腺素類和非甾體類抗炎藥物(NSAIDs)三種，激活了表達于單核細胞，角質(zhì)化細胞等細胞核內(nèi)的核受體PPAR-γ以后，通過與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的相互作用來調(diào)節(jié)促炎癥因子的表達。也有文獻報道，PPAR-γ激動劑通過抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移和通過形成PPAR-γ-p65復(fù)合物，來減少NF-κB p65與其靶核苷酸調(diào)節(jié)序列的結(jié)合。在本研究中，我們選擇噻唑烷二酮

26、類藥物匹格列酮(pioglitazone)，它是PPAR-γ受體的一種藥理性激動劑，作為PPAR-γ激動劑的代表，在體外實驗檢測PPAR-γ激動劑對系統(tǒng)性紅斑狼瘡單核細胞異?；罨淖饔眉捌錂C制，在前面報道的對狼瘡鼠的有效的治療作用的基礎(chǔ)上，進一步探測它的對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療作用。
　　 目的:
　　 在本研究中，我們探索免疫復(fù)合物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者單核細胞異?；罨鸬淖饔眉捌錆撛诘臋C制，并且為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者單核

27、細胞異?；罨岢鲆环N可能的治療方法。
　　 方法:
　　 1.把人單核細胞白血病細胞株U937以每孔106個細胞的密度接種到6孔板中，將細胞分組，分別與sRAGE(20μg/ml)，ODN2088(12μg/ml)，Bay117082(1μM)或者PPAR-γ激動劑匹格列酮(10μM)孵育1小時，然后加入免疫復(fù)合物。孵育2小時后，用Western Blot的方法來檢測NF-κB家族成員p65在細胞核中水平的變化，用免疫沉

28、淀的方法檢測PPAR-γ-p65復(fù)合物的形成。孵育6小時后，用熒光實時定量RT-PCR的方法來檢測基因RAGE，IL-6，TNF-α和MCP-1 mRNA水平的變化。孵育16小時后，用流式和Western Blot的方法來檢測RAGE蛋白表達的變化。孵育24小時后，用ELISA的方法來檢測細胞上清液中細胞因子IL-6,TNF-α和MCP-1的濃度的變化，用Transwell的方法來檢測單核細胞跨血管內(nèi)皮細胞遷移的變化。
　　 2

29、.在檢測細胞活性的實驗中，把人單核細胞白血病細胞株U937以每孔5×105個細胞的密度接種到12孔板中，將細胞分組，分別與sRAGE(20μg/ml)，ODN2088(12μg/ml)，Bay117082(1μM)或者PPAR-γ激動劑匹格列酮(10μM)孵育24小時。分別用細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞總數(shù)，臺盼藍染色活細胞數(shù)以及CCK-8的方法來檢測細胞活性的變化。
　　 3.實驗中，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均

30、數(shù)±標準誤來表示。不同實驗組之間的差異用單因素方差分析進行分析，兩組數(shù)據(jù)之間的比較用t檢驗進行分析，P值＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫復(fù)合物通過TLR9介導(dǎo)的NF-κB的活化上調(diào)人單核細胞表面受體RAGE的表達，這一作用可被PPAR-γ激動劑抑制。
　　 2.免疫復(fù)合物通過RAGE/TLR9介導(dǎo)的NF-κB的活化增加人單核細胞細胞因子IL-6，MCP-1和TNF-α的分泌，這一作用

31、可能被PPAR-γ激動劑抑制。
　　 3.免疫復(fù)合物通過RAGE/TLR9介導(dǎo)的NF-κ B的活化增強單核細胞跨血管內(nèi)皮細胞遷移，這一作用可被PPAR-γ激動劑抑制。
　　 4.免疫復(fù)合物通過RAGE/TLR9介導(dǎo)的NF-κB的活化增加人單核細胞NF-κB家族成員p65的核轉(zhuǎn)移，這一作用可被PPAR-γ激動劑抑制。
　　 5.PPAR-γ激動劑匹格列酮通過以劑量依賴的形式形成PPAR-γ-p65復(fù)合物抑制免疫復(fù)合

32、物誘導(dǎo)的人單核細胞NF-κB p65的活化。
　　 6.實驗中用到的sRAGE，ODN2088，Bay117982和匹格列酮對單核細胞沒有細胞毒性。
　　 結(jié)論:
　　 本研究證實了免疫復(fù)合物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡單核細胞異常活化所起的作用并且對免疫復(fù)合物如何導(dǎo)致單核細胞異?；罨峁┝艘环N可能的機制，這為系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制的研究提供了重要證據(jù)。另外，本研究對系統(tǒng)性紅斑狼瘡單核細胞異?；罨岢隽艘环N可能的治療方法，這