髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1在單核細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1表達(dá)水平與凋亡的相關(guān)性
　　 研究目的:
　　 髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1（TREM-1）分子是主要表達(dá)于外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面的受體，能夠放大Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和Nod樣受體(Nod-like receptors，NLRs)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在膿毒癥等炎癥性疾病發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。但是TREM-1在膿毒癥單核細(xì)胞和中

2、性粒細(xì)胞凋亡中的作用尚未明確。因此，本部分研究通過檢測(cè)膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TREM-1的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率，分析細(xì)胞TREM-1的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性。
　　 研究方法:
　　 本研究納入2012年7月1日至2012年9月4日大學(xué)附屬醫(yī)院外科ICU新入院膿毒癥患者為研究組，排除化療、艾滋病、激素治療和器官移植等患者。所有納入患者在入住重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit，ICU

3、)24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行APACHEⅡ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ)評(píng)分和SOFA(Sequential OrganFailure Assessment)評(píng)分。所有納入患者在入住ICU24小時(shí)內(nèi)均抽取全血檢測(cè)全血中單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的凋亡水平;同時(shí)將全血中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分離，檢測(cè)兩種細(xì)胞TREM-1的表達(dá)水平。分別分析單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與其凋亡率

4、的相關(guān)性。
　　 研究結(jié)果:
　　 本研究共納入外科ICU中符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的26例患者。在原發(fā)疾病中最常見的為急性腹膜炎(26.9％)和肺炎(26.9％)，其他還包括急性化膿性梗阻性膽管炎和急性重癥胰腺炎等。其中16例患者細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽性，另外10例患者存在臨床感染證據(jù)。所有患者的外周血單核細(xì)胞都檢測(cè)到TREM-1表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率，相關(guān)性分析顯示單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平和單核細(xì)胞凋亡率成負(fù)相關(guān)(r=-0.49

5、,P=0.01)。此外，26例患者中有22例成功檢測(cè)到中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞凋亡率，4例患者檢測(cè)失敗。中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞凋亡率之間無顯著相關(guān)性(r=-0.28，P=0.21)。
　　 研究結(jié)論:
　　 膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與單核細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，中性粒細(xì)胞TREM-1表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞凋亡率無顯著相關(guān)性。研究結(jié)果提示:TREM-1在單核細(xì)胞抗凋亡中可

6、能具有重要作用。
　　 第二部分 TREM-1在單核細(xì)胞凋亡中的作用并初步探討其分子機(jī)制
　　 研究目的:
　　 通過構(gòu)建攜帶TREM-1基因的重組腺病毒表達(dá)載體，獲得高表達(dá)TREM-1的單核細(xì)胞，進(jìn)行TREM-1在單核細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制的研究，探討Erk和PI3K/Akt通路和Bcl-2蛋白家族在該凋亡機(jī)制中的作用。
　　 研究方法:
　　 構(gòu)建高表達(dá)TREM-1的腺病毒表達(dá)載體，感染單核

7、細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TREM-1蛋白的表達(dá)水平。以高表達(dá)TREM-1的THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，采用激動(dòng)性抗體激活TREM-1通路，或同時(shí)用100 ng/ml脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激，隨后用星形孢菌素（staurosporine，STS）誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。采用化學(xué)抑制試驗(yàn)觀察細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-sign

8、al-regulated kinase，Erk）通路和磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/Akt通路對(duì)TREM-1分子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。采用Western blot法技術(shù)檢測(cè)Bcl-2蛋白家族在TREM-1分子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的表達(dá)水平變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 Western-blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)TREM-1重組腺病毒載體構(gòu)建成功，能在單核細(xì)胞系THP

9、-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。激活TREM-1通路能顯著降低STS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的凋亡率(41.8％ vs.63％，p＜0.05)，且在LPS刺激誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞（體外炎癥模型）中也得到了相似的結(jié)果(33.7％ vs.54.3％，p＜0.05)。用化學(xué)藥物抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal-regulated kinase，Erk）或磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase

10、，PI3K)/Akt通路的活化，能夠減弱TREM-1對(duì)THP-1凋亡的抑制作用（Erk抑制劑:29.8％ vs.77.7％，p＜0.05;PI3K/Akt抑制劑:29.8％ vs.69.3％，p＜0.05）。Westem blot結(jié)果顯示TREM-1的激活不僅能顯著地提高Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)的表達(dá)，而且還能逆轉(zhuǎn)STS對(duì)Mcl-1蛋白的抑制作用(p＜

11、0.05)。
　　 研究結(jié)論:
　　 本研究證實(shí)激活TREM-1對(duì)單核細(xì)胞具有抗凋亡作用，其機(jī)制可能與Erk和Akt信號(hào)通路的激活、以及下游抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)升高有關(guān)。
　　 第三部分明確Mcl-1分子在TREM-1介導(dǎo)單核細(xì)胞抗凋亡通路中的
　　 重要作用
　　 研究目的:
　　 探討上述研究中發(fā)現(xiàn)的髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)

12、蛋白在單核細(xì)胞TREM-1抗凋亡通路中的確切作用，從而明確單核細(xì)胞表面TREM-1分子在細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)控中的重要作用。
　　 研究方法:
　　 以高表達(dá)TREM-1的THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，采用化學(xué)抑制劑抑制TREM-1通路的下游分子Erk和Akt，Western blot方法檢測(cè)Mcl-1蛋白水平的變化。采用激動(dòng)性TREM-1抗體激活TREM-1受體后，加入特異性抑制Mcl-1蛋白表達(dá)的Roscovitine(20

13、μM)與0.6μg/ml STS，流式細(xì)胞術(shù)觀察Mel-1蛋白抑制后對(duì)TREM-1發(fā)揮抗凋亡作用的影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 抑制Erk和/或Akt信號(hào)分子均導(dǎo)致Mcl-1蛋白表達(dá)顯著下降(p＜0.05)。20μMRoscovitine處理4小時(shí)后，TREM-1-THP-細(xì)胞的Mcl-1蛋白表達(dá)明顯被抑制(p＜0.05)。將激活TERM-1通路的TREM-1-THP-1細(xì)胞用20μM Roscovitine處理后，T