Exendin-4對(duì)燒傷小鼠脾臟單核細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、危重病患者神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活和炎癥介質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生造成代謝紊亂，出現(xiàn)高分解代謝和胰島素抵抗，引起血糖升高，進(jìn)一步損傷機(jī)體，并且對(duì)免疫系統(tǒng)造成損害，降低機(jī)體抵抗力和修復(fù)能力?？刂蒲悄茱@著降低危重癥患者病死率，縮短監(jiān)護(hù)和住院時(shí)間，減少并發(fā)癥。而新型腸促胰島素類(lèi)降糖藥物，如胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide1，GLP-1）及其類(lèi)似物具有降低血糖和調(diào)節(jié)炎癥的雙重作用，理論上認(rèn)為應(yīng)用于危重癥患者具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。臨床試驗(yàn)

2、也證實(shí)GLP-1對(duì)危重癥患者高血糖有良好的治療前景，但是也有臨床研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者使用GLP-1類(lèi)似物可能會(huì)引起胰腺炎等副作用。
　　GLP-1類(lèi)似物在危重癥的基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，在危重癥患者復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中，GLP-1及其類(lèi)似物的免疫調(diào)節(jié)作用還不明確。危重癥患者面臨極大的感染風(fēng)險(xiǎn)，而單核細(xì)胞在抵抗病原菌入侵和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)方面有重要作用?，F(xiàn)已明確GLP-1類(lèi)似物能抑制脂肪巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但對(duì)危重癥患者單核細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作

3、用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠燙傷模型，旨在探討危重病的病理情況下GLP-1長(zhǎng)效類(lèi)似物Exendin-4(Ex-4)對(duì)單核細(xì)胞免疫功能的調(diào)控以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為Ex-4等腸胰泌素類(lèi)藥物在危重癥的應(yīng)用提供預(yù)警。
　　目的:
　　(1)闡明Exendin-4對(duì)燒傷小鼠脾臟單核細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。
　　(2)探討Exendin-4影響燒傷小鼠脾臟單核細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:
　　(1)使用

4、細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑檢測(cè)Ex-4對(duì)燙傷小鼠脾臟單核細(xì)胞和假傷小鼠脾臟單核細(xì)胞增殖活性的改變，并分析量效關(guān)系。(2)熒光顯微鏡觀察單核細(xì)胞Gαs(stimulating G proteinα-subunit)和Gαi(inhibitory G proteinα-subunit)的表達(dá)，激光共聚焦觀察GLP-1R(glucagon-like peptide1 receptor)、GRK-2(G-protein-coupled recept

5、or kinase2)的表達(dá)情況。采用Western Blot檢測(cè)燙傷小鼠和假傷小鼠單核細(xì)胞GLP-1R、GRK-2、Gαs和Gαi的表達(dá)差異。ELISA檢測(cè)小鼠脾臟單核細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β分泌水平，觀察Ex-4對(duì)燙傷后單核細(xì)胞的免疫功能的影響。ELISA檢測(cè)Ex-4處理的小鼠脾臟單核細(xì)胞中cAMP和PKA的變化，觀察燙傷后單核細(xì)胞Ex-4的信號(hào)通路變化。(3)采用百日咳毒素(pertussis toxin，

6、PTX)阻斷Gαi，采用Forskolin（腺苷酸環(huán)化酶激活劑）和IBMX（磷酸二酯酶抑制劑）增加cAMP含量以及H89阻斷PKA，再給予Ex-4刺激，觀察上述指標(biāo)的變化，明確燙傷后GLP-1R信號(hào)通路的改變是否能導(dǎo)致Ex-4免疫調(diào)控功能的異常。
　　結(jié)果:
　　(1)Ex-4對(duì)單核細(xì)胞活性的影響:結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ex-4可降低單核細(xì)胞活性。中、高劑量Ex-4處理的假傷組單核細(xì)胞活性均顯著低于燙傷組(P＜0.05)，而燙傷組細(xì)胞增殖

7、活性變化不明顯。
　　(2)重度燙傷對(duì)Ex-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變:①燙傷后脾臟單核細(xì)胞Ex-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子包括GLP-1R、GRK-2和Gαs含量均下降(P＜0.05)，而Gαi含量升高(P＜0.05)。②高劑量Ex-4對(duì)燙傷組單核細(xì)胞cAMP的促進(jìn)作用較假傷組顯著降低(P＜0.05)，但是PKA水平反而高于假傷組(P＜0.05)。
　　(3)Ex-4對(duì)燙傷小鼠單核細(xì)胞免疫調(diào)控作用發(fā)生改變:①Ex-4作用后，燙傷組單核細(xì)

8、胞分泌TNF-α增加(P＜0.05)，而假傷組沒(méi)有顯著改變。②兩組單核細(xì)胞IL-6的分泌均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性增加(P＜0.05)，但兩組之間無(wú)顯著差異。③兩組IL-10的分泌均呈劑量依賴(lài)性增加，假傷組中濃度Ex-4促進(jìn)效應(yīng)已很明顯(P＜0.05)，但燙傷組僅高濃度Ex-4具有促進(jìn)作用(P＜0.05)。④Ex-4對(duì)兩組TGF-β分泌均起顯著抑制作用(P＜0.05)，在假傷組呈顯著的劑量依賴(lài)性，但是在燙傷組不同濃度Ex-4的抑制效應(yīng)沒(méi)有顯著差異

9、。
　　(4)PTX阻斷Gαi、Forskolin和IBMX增加cAMP、H89阻斷PKA后，再給予Ex-4刺激，觀察上述指標(biāo)的變化:①PTX單獨(dú)作用能夠增加燙傷組單核細(xì)胞IL-6、TNF-α分泌，加入Ex-4擴(kuò)大這一效應(yīng)(P＜0.05)。②PTX、Forskolin和IBMX無(wú)論單獨(dú)作用還是與Ex-4共同作用相對(duì)于單獨(dú)使用Ex-4均能減少單核細(xì)胞分泌IL-10(P＜0.05)。③H89能促進(jìn)假傷組單核細(xì)胞分泌TNF-α，與Ex-

10、4共同作用的效果也一致(P＜0.05)，但是在燙傷組無(wú)論H89單獨(dú)作用還是與Ex-4共同作用都不能明顯改變單核細(xì)胞分泌TNF-α的量。④H89能促進(jìn)假傷組單核細(xì)胞分泌MCP-1(P＜0.05)，但是抑制燙傷組單核細(xì)胞分泌MCP-1(P＜0.05)，Ex-4與H89共同作用比H89單獨(dú)作用能促進(jìn)假傷組單核細(xì)胞分泌更多的MCP-1(P＜0.05)，燙傷組無(wú)這一作用。
　　結(jié)論:
　　(1)Ex-4能刺激單核細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生促炎和抗炎

11、的細(xì)胞因子，表明在重度燙傷后Ex-4的免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)生改變，提示臨床GLP-1治療危重癥時(shí)應(yīng)注意GLP-1及其類(lèi)似物藥理作用的改變。
　　(2)重度燙傷后，Ex-4作用于小鼠脾臟單核細(xì)胞的信號(hào)通路關(guān)鍵分子發(fā)生明顯變化，影響Ex-4對(duì)單核細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　(3)Ex-4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有很強(qiáng)的免疫抑制作用，通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP和PKA可能糾正GLP-1及其類(lèi)似物在危重病的中的促炎作用，使GLP-1及其類(lèi)似物達(dá)到即控制血糖又改