Exendin-4對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞脂性凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、前言:
　　 目前脂毒性被認(rèn)為是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)的主要發(fā)病機(jī)制之一。生理?xiàng)l件下，一定的糖和脂對(duì)于胰島功能的維持是必不可少的。但是，慢性持續(xù)性的處在高脂環(huán)境中卻可引發(fā)胰島β細(xì)胞胰島素基因表達(dá)受損，胰島素合成、分泌減少及細(xì)胞凋亡。而β細(xì)胞凋亡異常增多則是導(dǎo)致β細(xì)胞數(shù)目減少的重要原因之一。因此從保護(hù)胰島β細(xì)胞的角度看，維持胰腺組織中殘存β細(xì)胞的功能及數(shù)量，對(duì)阻止糖尿病的進(jìn)展至關(guān)重要

2、。鑒于β細(xì)胞的凋亡及脂毒性在糖尿病病理生理機(jī)制中的重要地位和作用，開(kāi)展相關(guān)藥物有關(guān)對(duì)抗脂毒性損傷作用的研究便具有重要意義。
　　 胰高血糖素樣肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是一種生理性肽類(lèi)激素，主要由回腸末端、結(jié)腸和直腸中的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞L細(xì)胞分泌。無(wú)論在動(dòng)物還是在糖尿病患者體內(nèi)，GLP-1均可通過(guò)和β細(xì)胞上的GLP-1受體結(jié)合，增強(qiáng)葡萄糖依賴(lài)的胰島素分泌。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1還

3、具有其他一些重要的生物學(xué)功能，包括調(diào)控胰島β細(xì)胞特異性基因表達(dá)，促進(jìn)其分化增殖及再生，抑制凋亡，有效的保護(hù)胰島β細(xì)胞的數(shù)量及功能等。而無(wú)論是1型還是2型糖尿病，胰島β細(xì)胞數(shù)量和功能都對(duì)其臨床進(jìn)程起著重要作用，故GLP-1及其類(lèi)似物被認(rèn)為是糖尿病治療具有前景的重要物質(zhì)之一。Exendin-4是GLP-1受體的長(zhǎng)效激動(dòng)劑，能發(fā)揮與GLP-1相近的血糖調(diào)節(jié)作用，并具有相似的抗細(xì)胞凋亡、促胰島細(xì)胞增殖作用。而對(duì)于T2DM的主要機(jī)制之一，脂毒性誘

4、導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，Exendin-4能否發(fā)揮其保護(hù)作用，改善β細(xì)胞數(shù)量及功能，目前報(bào)道尚少，因此本研究的目的主要是探討Exendin-4能否保護(hù)胰島β細(xì)胞拮抗脂毒性的毒副作用以及對(duì)相關(guān)機(jī)制的探索。
　　 本實(shí)驗(yàn)共分如下三部分進(jìn)行:
　　 第一部分:采用體外培養(yǎng)的小鼠胰腺β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞，用游離脂肪酸(Freefatty acid，F(xiàn)FA)（棕櫚酸）處理，探討脂毒性對(duì)胰島β細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)、凋亡等方面的影響。

5、r>　　 第二部分:應(yīng)用FFA（棕櫚酸）建立體外的脂毒性環(huán)境，然后用GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4處理，探討Exendin-4對(duì)胰島β細(xì)胞株生長(zhǎng)、凋亡的影響。
　　 第三部分:探討Exendin-4拮抗脂毒性凋亡的相關(guān)機(jī)制。
　　 第一部分游離脂肪酸誘導(dǎo)小鼠胰島β細(xì)胞凋亡的研究
　　 前言:
　　 T2DM中常伴有脂質(zhì)代謝紊亂，高FFA血癥是肥胖相關(guān)的T2DM代謝紊亂的特征之一。長(zhǎng)期處于高FFA

6、環(huán)境中可使周?chē)M織對(duì)胰島素的敏感性降低，并使胰島β細(xì)胞功能受損，使胰島素合成與分泌減少，最終導(dǎo)致胰島素抵抗和胰島素分泌障礙。另外FFA長(zhǎng)期升高對(duì)胰島β細(xì)胞的毒性作用可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡及壞死，使細(xì)胞數(shù)目減少。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體研究均發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞凋亡增加可能是T2DM胰島β細(xì)胞分泌胰島素功能不足的主要原因。因此高FFA誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡作用應(yīng)受到重視。
　　 本研究以小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞作為研究對(duì)象，選用體內(nèi)FFA含量比

7、例較高的棕櫚酸為代表建立脂環(huán)境，探索脂毒性對(duì)胰島β細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)、凋亡等方面的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 以小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)不同濃度棕櫚酸誘導(dǎo)刺激，探索脂毒性對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷作用。CCK8檢測(cè)不同濃度棕櫚酸(0.1-0.5mM)作用不同時(shí)間(24h、48h)對(duì)MIN6細(xì)胞活性的影響，Hoechst33258熒光染色法、Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測(cè)不同濃

8、度棕櫚酸(0.1、0.2、0.4mM)作用24h后細(xì)胞的凋亡率，酶聯(lián)法檢測(cè)不同濃度棕櫚酸(0.1、0.2、0.4mM)作用24h后細(xì)胞Caspase-3酶活性，電鏡觀察細(xì)胞凋亡的微觀結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:
　　 1、不同濃度棕櫚酸作用MIN6細(xì)胞24h及48h，可明顯抑制MIN6細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈一定的時(shí)效和量效關(guān)系。
　　 2、隨著棕櫚酸濃度的逐漸升高，其誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡和促進(jìn)Caspase-3活性升高的作用逐

9、漸增強(qiáng)。
　　 3、電鏡觀察棕櫚酸的毒性使胰島β細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重受損，核皺縮，染色質(zhì)凝聚，胞漿中的分泌顆粒減少或消失。
　　 結(jié)論:
　　 棕櫚酸可抑制胰島β細(xì)胞MIN6的細(xì)胞活性，并呈一定的時(shí)效和量效關(guān)系。其產(chǎn)生的脂毒性濃度依賴(lài)性的誘導(dǎo)了MIN6細(xì)胞凋亡，升高了MIN6細(xì)胞的Caspase-3活性，并可引起細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的改變。
　　 第二部分Exendin-4對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響
　

10、　 前言:
　　 GLP-1主要在小腸組織中表達(dá)，由30多個(gè)氨基酸殘基組成，是腸促胰素的主要成分。GLP-1可以迅速降低空腹及餐后血糖水平，具有葡萄糖依賴(lài)性的促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素生成釋放，延遲胃排空、抑制食欲等生理功能。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1還具有其他一些重要的生物學(xué)功能，它可調(diào)控胰島β細(xì)胞特異性基因表達(dá)，促進(jìn)其分化增殖及再生，抑制凋亡，有效的保護(hù)胰島β細(xì)胞的數(shù)量及功能等。而無(wú)論是1型還是2型糖尿病，胰島β

11、細(xì)胞數(shù)量和功能都對(duì)其臨床進(jìn)程起著重要作用，故GLP-1被認(rèn)為是糖尿病治療具有前景的重要物質(zhì)之一。Exendin-4是GLP-1受體的長(zhǎng)效激動(dòng)劑，有53％的氨基酸序列與哺乳動(dòng)物GLP-1重疊，能發(fā)揮與GLP-1相近的血糖調(diào)節(jié)作用，并具有相似的抗細(xì)胞凋亡及促胰島細(xì)胞增殖作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Exendin-4可以耐受體內(nèi)二肽基肽酶Ⅳ(DipeptidylpeptidaseⅣ，DPP-Ⅳ)的降解，與GLP-1相比具有更長(zhǎng)的血漿半衰期，這些特點(diǎn)都

12、為GLP-1及其類(lèi)似物應(yīng)用于臨床治療提供了新的契機(jī)。而對(duì)于T2DM的主要機(jī)制之一，脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，Exendin-4能否發(fā)揮保護(hù)作用，改善細(xì)胞數(shù)量及功能，目前相關(guān)報(bào)道尚少，因此有待進(jìn)一步的探索研究。
　　 本研究在體外環(huán)境培養(yǎng)胰島β細(xì)胞株MIN6，應(yīng)用棕櫚酸建立脂毒性環(huán)境，探討Exendin-4對(duì)胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 在脂毒性條件下，以不同濃度Exendin-4處理細(xì)胞

13、，觀察Exendin-4對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞脂性凋亡的保護(hù)作用。在脂毒性環(huán)境下（棕櫚酸0.4mM），CCK8檢測(cè)不同濃度Exendin-4(1、10、100、500nM)作用24h時(shí)間后對(duì)MIN6細(xì)胞活性的影響，Hoechst33258熒光染色法、AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測(cè)Exendin-4(100nM)作用24h后細(xì)胞的凋亡率，酶聯(lián)法檢測(cè)Exendin-4(100nM)作用24h后細(xì)胞Caspase-

14、3酶活性。
　　 結(jié)果:
　　 1、在脂毒性條件下，隨著Exendin-4濃度的升高，細(xì)胞存活率明顯升高，并呈一定量效關(guān)系，在Exendin-4濃度為100nM時(shí)，其促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用最強(qiáng)(P＜0.01)。
　　 2、在脂毒性條件下，Exendin-4能顯著拮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡(P＜0.01)，并抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的Caspase-3活性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 Exendin-

15、4可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞MIN6生長(zhǎng)，在脂毒性條件下提高細(xì)胞活性。同時(shí)Exendin-4可拮抗脂毒性誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡，并降低MIN6細(xì)胞的Caspase-3活性。
　　 第三部分Exendin-4拮抗脂毒性保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制研究
　　 前言:
　　 蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellularregulated protein kinases，ERK)

16、分別是在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶。在胰島中可促進(jìn)β細(xì)胞的增殖，阻斷細(xì)胞凋亡通路。大量實(shí)驗(yàn)證明了它們?cè)谡{(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)方面扮演著重要的角色。不斷有證據(jù)顯示，通過(guò)其自身磷酸化的激活可保護(hù)胰島β細(xì)胞抵抗糖脂毒性的毒副作用。我們的研究顯示Exendin-4對(duì)于T2DM的主要機(jī)制之一，脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，而Exendin-4這種保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用機(jī)制是否是通過(guò)上述信號(hào)通路得以實(shí)施，有待于進(jìn)一步的研

17、究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、采用Western blot法檢測(cè)在脂環(huán)境下（棕櫚酸0.4mM），Exendin-4干預(yù)不同時(shí)間、不同濃度(1、10、100、500nM)及在各自信號(hào)通路阻斷劑存在的條件下，MIN6細(xì)胞內(nèi)p-PKB(ser473)、總PKB，p-ERK1/2、總ERK1/2蛋白水平的表達(dá)。再以CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性，Hoechst33258熒光染色法、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。2、采用Real-ti

18、me RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在脂環(huán)境下(棕櫚酸0.4mM)及Exendin-4(100nM)干預(yù)24h后Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、0.4mM棕櫚酸干預(yù)MIN6細(xì)胞24h后可見(jiàn)PKB蛋白的磷酸化明顯受到抑制(P＜0.01)，而加入100nM的Exendin-4處理細(xì)胞后，可見(jiàn)PKB蛋白磷酸化的快速激活，在30min處達(dá)到作用高峰(P＜0.05)。Exendin-4濃度依賴(lài)性的誘導(dǎo)

19、了PKB蛋白磷酸化的激活，100nM濃度時(shí)作用最顯著(P＜0.01)。Exendin-4誘導(dǎo)的PKB蛋白磷酸化的激活能顯著被PI3K特異性阻斷劑(LY294002)所阻斷(P＜0.05)。并且，應(yīng)用Hoechst33258染色法和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡證明，Exendin-4抑制脂毒性誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用被PI3K阻斷劑所阻斷(P＜0.01)。
　　 2、0.4mM棕櫚酸干預(yù)MIN6細(xì)胞24h后可見(jiàn)ERK1/2蛋白的

20、磷酸化明顯受到抑制(P＜0.05)，而加入100nM的Exendin-4處理細(xì)胞后，可見(jiàn)ERK1/2蛋白磷酸化的快速激活，在5min處達(dá)到作用高峰(P＜0.01)。Exendin-4濃度依賴(lài)性的刺激了ERK1/2蛋白磷酸化的激活，100nM濃度時(shí)作用最顯著(P＜0.01)。Exendin-4誘導(dǎo)的ERK1/2蛋白磷酸化的激活顯著被其阻斷劑(PD98059)所阻斷(P＜0.05)。并且應(yīng)用CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率及Hoechst33258染

21、色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡證明，Exendin-4促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用被ERK1/2阻斷劑所阻斷(P＜0.05)，且Exendin-4抑制脂毒性誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用同樣被ERK1/2阻斷劑所顯著阻斷(P＜0.05)。
　　 3、棕櫚酸可顯著下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，上調(diào)Bax mRNA的表達(dá)(P＜0.01)及促進(jìn)Caspase-3活性(P＜0.01)。而加入100nMExendin-4能顯著促進(jìn)Bcl-2 m

22、RNA的表達(dá)(P＜0.05)，并同時(shí)抑制Bax mRNA的表達(dá)(P＜0.05)及Caspase-3活性(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、Exendin-4保護(hù)MIN6細(xì)胞拮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的脂性凋亡與PI3K/PKB信號(hào)通路有關(guān)。
　　 2、Exendin-4保護(hù)MIN6細(xì)胞、拮抗脂毒性作用與ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。
　　 3、脂毒性條件下，Exendin-4的抗凋亡作用涉及線(xiàn)粒體途徑。
　

23、　 小結(jié)
　　 本研究以小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞作為研究對(duì)象，選用體內(nèi)FFA含量比例較高的棕櫚酸為代表建立脂環(huán)境，探索脂毒性對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了棕櫚酸可抑制胰島β細(xì)胞的細(xì)胞活性，并有誘導(dǎo)其凋亡作用。鑒于β細(xì)胞的凋亡及脂毒性在糖尿病病理生理機(jī)制中的重要地位和作用，研究藥物是否具備對(duì)抗高脂環(huán)境誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的作用，即拮抗脂毒性損傷的保護(hù)作用便具有重要意義。因此本實(shí)驗(yàn)著重研究了GLP-1受體激動(dòng)劑Exend

24、in-4在此方面的作用，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Exendin-4不僅可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)，在脂毒性條件下提高細(xì)胞活性，且具備拮抗脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)為了進(jìn)一步明確Exendin-4發(fā)揮如上保護(hù)作用的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)圍繞PI3K/PKB信號(hào)通路、ERK1/2信號(hào)通路及線(xiàn)粒體途徑展開(kāi)研究，證實(shí)了該保護(hù)作用涉及如上通路。
　　 脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是和肥胖相關(guān)的T2DM的主要機(jī)制之一，減少脂毒性對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷可