Exendin-4對(duì)高糖條件下大鼠系膜細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制初探.pdf

1、背景：
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者臨床常見(jiàn)的一種微血管并發(fā)癥。DN早期的主要病理特點(diǎn)是腎臟肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚以及以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)積聚。DN嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。在西方國(guó)家，DN也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。目前，在世界范圍內(nèi)，隨著糖尿病的患病率增高，DN的患病率也日

2、益增高，DN嚴(yán)重影響了患者的正常生活，并且給人們帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)壓力，已經(jīng)成為一項(xiàng)嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　 腎小球系膜區(qū)主要由系膜細(xì)胞和其產(chǎn)生的ECM構(gòu)成的。越來(lái)越多的證據(jù)表明系膜細(xì)胞在DN的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。系膜細(xì)胞是腎小球的固有細(xì)胞，系膜細(xì)胞的生理作用多樣，具體包括如下幾個(gè)方面:1、對(duì)腎小球毛細(xì)血管袢有支持和保護(hù)作用;2、可產(chǎn)生多種ECM，主要包含Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、纖連蛋白等，并在病變情況下致腎小球硬化;

3、3、系膜細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，通過(guò)自分泌及旁分泌途徑參與腎小球炎癥反應(yīng);4、系膜細(xì)胞通過(guò)收縮和舒張控制腎小球毛細(xì)血管的血流量，進(jìn)而調(diào)節(jié)腎小球的濾過(guò)功能以及系膜通道的功能;5、系膜細(xì)胞可通過(guò)吞噬作用轉(zhuǎn)運(yùn)血漿大分子物質(zhì);6、系膜細(xì)胞可參與免疫反應(yīng);7、某些系膜細(xì)胞還具有內(nèi)分泌功能，可以分泌腎素。在正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)成熟的系膜細(xì)胞以靜止表型的形式存在，其增殖與凋亡及ECM的分泌與降解保持在一種動(dòng)態(tài)平衡，其合成基質(zhì)的能力也較小。但高血糖、血

4、流動(dòng)力學(xué)改變、代謝失調(diào)等均可使系膜細(xì)胞活化，系膜數(shù)量增加凋亡減少以及基質(zhì)金屬蛋白酶的減少，以及由此引起的FN、ColⅣ等的增多，最終導(dǎo)致過(guò)多的ECM的積聚。
　　 一些臨床研究如“糖尿病控制與并發(fā)癥試驗(yàn)”(diabetes control andcomplications trial，DCCT)和“糖尿病控制與并發(fā)癥的流行病學(xué)研究”(epidemiology of diabetes interventions and compl

5、ications，EDIC)以及“英國(guó)前瞻性糖尿病研究”(the UK Prospective Diabetes Study，UKPDS)等均表明高血糖和DN的發(fā)生有密切的聯(lián)系，高糖環(huán)境能促進(jìn)DN特征性、漸進(jìn)性細(xì)胞損傷和功能下降，并指出嚴(yán)格的血糖控制可明顯減少DN發(fā)生率。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可通過(guò)以下幾條途徑引起系膜細(xì)胞的改變。1、DAG信號(hào)通路:高糖條件下，過(guò)多的葡萄糖可通過(guò)糖酵解途徑合成大量的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮，磷酸二

6、羥丙酮通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)最終生成DAG。DAG可激活PKC，促使系膜細(xì)胞肥大、合成過(guò)多的ECM。2、長(zhǎng)期慢性高血糖可形成AGE，AGE通過(guò)自身氧化產(chǎn)生ROS，最終激活TGFβ信號(hào)通路。3、氨基己糖通路:當(dāng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的濃度增高時(shí)，通過(guò)糖酵解途徑合成的6-磷酸果糖大量增加，從而促使更多葡萄糖進(jìn)入氨基己糖合成通路，導(dǎo)致系膜細(xì)胞合成ECM增多。4、多元醇途徑:大量的葡萄糖進(jìn)入醛糖還原酶途徑，導(dǎo)致山梨醇的增多和抗氧化劑大量消耗，ROS含量增加，

7、進(jìn)一步激活PKC、絲裂原活化蛋白激酶途徑和JAK-STAT途徑，從而誘發(fā)系膜細(xì)胞發(fā)生一系列的改變。
　　 氧在機(jī)體組織的正常代謝反應(yīng)中，可以形成一些自由基。自由基的種類很多，與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的主要為ROS，包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)、過(guò)氧化氫(H2O2)等。正常情況下，自由基的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡。但在高糖、高脂、炎癥等病理情況下，體內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯增加，機(jī)體抗氧化防御能力下降，過(guò)多的ROS直接引起生物膜脂

8、質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性、DNA損傷，最后導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷。ROS本身還是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信使，介導(dǎo)和活化多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，造成組織和細(xì)胞的損傷。高糖條件下系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激主要來(lái)源于線粒體呼吸鏈、NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶等。高糖還可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞生成過(guò)多的氧自由基，這些氧自由基通過(guò)激活多元醇途徑、AGEs途徑、PKC途徑，形成正反饋，進(jìn)一步促進(jìn)自由基的產(chǎn)生。
　　 PKC是一組密切相關(guān)的有多種亞型的絲氨

9、酸/蘇氨酸激酶家族的成員之一，廣泛存在于各組織細(xì)胞內(nèi)，它處于細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心，參與體內(nèi)很多生理、病理過(guò)程。正常生理情況下，PKC存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并處于失活狀態(tài)，受到外界刺激時(shí)其特異性底物蛋白吸引PKC由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，PKC的構(gòu)象發(fā)生改變，PKC處于激活狀態(tài)。PKC的膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象為PKC激活的重要標(biāo)志。
　　 研究指出，糖代謝異常可通過(guò)一系列途徑促進(jìn)DAG合成，促進(jìn)PKC活化。至此，DAG-PKC通路激活與DN的關(guān)

10、系引起眾多關(guān)注。研究證實(shí)，總的PKC抑制劑如staurosporine或者calphostin C均可抑制高糖條件下FN的積聚和ColⅣ的表達(dá)，而PKC激動(dòng)劑則可促進(jìn)FN的積聚和ColⅣ的表達(dá)。以上這些結(jié)果表明高糖可能通過(guò)PKC的活化來(lái)調(diào)節(jié)ECM的合成。高糖通過(guò)PKC活化來(lái)促進(jìn)TGF-β1和ECM的表達(dá)，其機(jī)制可能是TGF-β基因啟動(dòng)子含有活化素結(jié)合蛋白-1的結(jié)合位點(diǎn)，而活化的PKC可調(diào)節(jié)原癌基因c-fos和c-jun表達(dá)，c-fos和

11、c-jun結(jié)合成異二聚體AP-1樣轉(zhuǎn)錄因子，AP-1可與TGF-β基因啟動(dòng)子相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)TGF-β的表達(dá)。還有研究證實(shí)高糖條件下腎小球系膜細(xì)胞經(jīng)由NADPH氧化酶生成ROS，這一過(guò)程依賴于PKC的活化，PKC的活化可明顯促進(jìn)糖尿病體內(nèi)ROS的生成。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factorβ，TGFβ)作為一種細(xì)胞間信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、免疫調(diào)節(jié)及

12、ECM合成中發(fā)揮重要作用。研究表明TGF-β可誘導(dǎo)ECM的成分如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，F(xiàn)N的表達(dá)增加;過(guò)量表達(dá)的TGF-β可將細(xì)胞阻滯于從G1期，抑制細(xì)胞增殖導(dǎo)致細(xì)胞肥大;很多研究表明DN中TGF-β系統(tǒng)促使腎臟肥大、腎小球硬化及腎小管間質(zhì)性纖維化;TGF-β可通過(guò)減少M(fèi)MPs的表達(dá)，促進(jìn)PAI-1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的合成來(lái)減少ECM的降解。系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染反義TGF-β1基因后，也能減少PAI-1 mRNA的表達(dá)，可見(jiàn)系膜細(xì)胞主要通過(guò)增加

13、PAI-1水平來(lái)抑制ECM降解;TGF-β1還具有強(qiáng)烈促纖維化作用，其過(guò)度生成或活性升高是腎臟纖維化過(guò)程中的主要的調(diào)節(jié)因子;高血糖可通過(guò)激活PKC、AGEs促進(jìn)TGF-β表達(dá)。TGF-β還能激活MAPK等信號(hào)傳導(dǎo)通路，而P38MAPK的激活又能進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β表達(dá)，從而形成正反饋通路導(dǎo)致TGF-β的持續(xù)激活。最新研究表明，Smads蛋白是TGF-β1與其細(xì)胞表面絲/蘇氨酸激酶受體結(jié)合后，將外界的信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核的過(guò)程中極其重

14、要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)介導(dǎo)分子。Li J等人研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞中，高糖可通過(guò)誘導(dǎo)Smad2、Smad4的表達(dá)，抑制Smad7的表達(dá)，誘導(dǎo)ECM合成增多。
　　 胰高糖素樣肽-1(Glucagon-like Peptide1，GLP-1)是腸促胰素的一種，由遠(yuǎn)端回腸和結(jié)腸的L細(xì)胞分泌。其主要生理作用包括:促進(jìn)胰島素的合成和分泌、抑制β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)β細(xì)胞增殖和新生、抑制胰高糖素分泌、減少食物攝取、延緩胃排空、增強(qiáng)外周組織的葡

15、萄糖利用和減少肝糖輸出。GLP-1通過(guò)葡萄糖依賴性的促胰島素的合成和分泌及抑制胰高糖素分泌雙向調(diào)節(jié)血糖。在健康個(gè)體中，空腹血糖主要由胰島素/胰高糖素的基礎(chǔ)分泌調(diào)節(jié)，但餐后血糖主要受胰島素/腸促胰素影響。
　　 艾塞那肽(exenatide)屬于GLP-1類似物，是目前國(guó)內(nèi)最早批準(zhǔn)上市的GLP-1受體激動(dòng)劑之一，其主要成分為exendin-4。Exendin-4是一種從北美希拉巨蜥唾液中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)效GLP-1受體激動(dòng)劑，其特殊的結(jié)構(gòu)

16、使exendin-4能更有效地抵抗體內(nèi)DPP-4的降解，半衰期延長(zhǎng)。Exendin-4近年越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于2型糖尿病的治療。Exendin-4和GLP-1具有相似的生理功能，可通過(guò)葡萄糖依賴的方式促進(jìn)胰島素分泌，調(diào)節(jié)空腹及餐后血糖，保護(hù)胰島β細(xì)胞。
　　 近期研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1經(jīng)由PKA降低了NADPH氧化酶的含量，進(jìn)一步降低了1型糖尿病大鼠模型的氧化應(yīng)激和尿白蛋白。還有研究指出exendin-4可減低1型糖尿病大鼠的炎癥反

17、應(yīng)，并且通過(guò)這一機(jī)制發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。長(zhǎng)期應(yīng)用exendin-4可顯著改善2糖尿病小鼠的尿白蛋白排泄率、減輕腎小球肥大和系膜區(qū)ECM積聚，同時(shí)還能改善小鼠的糖代謝、脂代謝等。以上研究表明GLP-1或者exendin-4可能對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用。
　　 前述提示，DN的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中系膜細(xì)胞在腎小球硬化和纖維化中起關(guān)鍵作用。在高糖條件下，系膜細(xì)胞產(chǎn)生一系列的變化，如氧化應(yīng)激增強(qiáng)、PKC激活等，這些信號(hào)分子均可導(dǎo)致TG

18、F-smad信號(hào)通路活化，最終引起系膜區(qū)ECM積聚，腎小球硬化和纖維化。現(xiàn)有的研究提示exendin-4可能對(duì)DN的腎臟具有保護(hù)作用，但是exendin-4發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚，目前關(guān)于這方面的研究較少。
　　 本課題以大鼠系膜細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察exendin-4對(duì)高糖條件下系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并探討其可能的保護(hù)機(jī)制，希望為exendin-4在治療2型糖尿病的同時(shí)，發(fā)揮DN保護(hù)作用提供更多的理論支持，為2型糖尿病的

19、治療方案提供一些參考。
　　 具體研究?jī)?nèi)容分為以下四部分:
　　 第一部分、Exendin-4對(duì)高糖條件下大鼠系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和ECM分泌的影響
　　 目的：觀察Exendin-4對(duì)高糖條件下大鼠系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和ECM分泌的影響。
　　 方法：
　　 1、以大鼠系膜細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。采用含10％胎牛血清的DMEM（低糖）完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。
　　

20、2、實(shí)驗(yàn)分組:
　　 各干預(yù)組分組（6組）:
　　 (1) control組:采用含糖5.6mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)
　　 (2) HG組:采用含糖30mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)
　　 (3) HG+E1組:采用exendin-4(1nmol/L)預(yù)處理24h，棄去培養(yǎng)基，然后加入含糖30mmol/LDMEM培養(yǎng)基和exendin-4（1nmol/L）共孵育。
　　 (4) HG+E

21、5組:采用exendin-4(5nmol/L)預(yù)處理24h，棄去培養(yǎng)基，然后加入高糖培養(yǎng)基和exendin-4(5nmol/L)共孵育。
　　 (5) HG+E10組:高糖(30mmol/L)+exendin-4（1Onmol/L）:采用exendin-4（10nmol/L）預(yù)處理24h，棄去培養(yǎng)基，然后加入高糖培養(yǎng)基和exendin-4(10nmol/L)共孵育。
　　 (6) HG+E15組:采用exendin-4(

22、15nmol/L)預(yù)處理24h，棄去培養(yǎng)基，然后加入高糖培養(yǎng)基和exendin-4(15nmol/L)共孵育。以上各組正式干預(yù)前均采用含0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，以保持各組細(xì)胞同步化生長(zhǎng)。
　　 3、分別在干預(yù)結(jié)束后，采用MTT法檢測(cè)增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期;Elisa法檢測(cè)細(xì)胞上清中ColⅣ和FN含量。
　　 4、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

23、，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);各組之間采用單因素方差分析(One-way ANOVA);方差齊時(shí)，多重比較采用LSD法。方差不齊時(shí)采用Welch法校正，當(dāng)P＜0.05時(shí)用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.Exendin-4對(duì)高糖條件下系膜細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響分別培養(yǎng)24h和48h后，與control組比較，HG組均可顯著促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖(P＜0

24、.01)。培養(yǎng)24h，與HG組比較，Exendin-4(5nmol/L、10 nmol/L、15 nmol/L)均可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。繼續(xù)培養(yǎng)至48h，不同濃度的Exendin-4均可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.Exendin-4對(duì)高糖條件下系膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響培養(yǎng)48h時(shí)結(jié)果顯示與control組相比，HG組能顯著促進(jìn)細(xì)胞由

25、G1期進(jìn)入S期，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期、G2細(xì)胞比例顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與HG組相比，Exendin-4(5nmol/L、10 nmol/L、15 nmol/L)可顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例，并且隨著exendin-4濃度的增高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜O.01）;Exendin-4(5nmol/L、10 nmol/L、15 nmol/L)可顯著降低S期細(xì)胞比例，ex

26、endin-4(10nmol/L、15 nmol/L)可顯著降低G2細(xì)胞比例，并且隨著exendin-4濃度的增高，S期、G2細(xì)胞比例逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)。
　　 3.Exendin-4對(duì)高糖條件下系膜細(xì)胞FN的影響與control組比較，培養(yǎng)24h和48h后HG組系膜細(xì)胞上清液中FN的合成顯著增加(P＜0.01);培養(yǎng)24 h后，Exendin-4(10nmol/L、15nmol/L)可顯著降低系膜細(xì)胞

27、上清液中FN的合成，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);培養(yǎng)48h后與HG組相比，Exendin-4(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)可顯著降低系膜細(xì)胞上清液中FN的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.Exendin-4對(duì)高糖條件下系膜細(xì)胞ColⅣ的影響與control組比較，HG組在24h和48h系膜細(xì)胞上清液中ColⅣ的合成顯著增加（P＜0.01）;培養(yǎng)24 h后，exendin-4(1

28、0nmol/L、15nmol/L)可顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅣ的合成(P＜0.01);培養(yǎng)48h后，exendin-4（5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L）對(duì)高糖刺激的系膜細(xì)胞上清液中ColⅣ的合成都有顯著的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 Exendin-4可顯著抑制高糖條件下系膜細(xì)胞的增殖，并將細(xì)胞阻滯于細(xì)胞G1期;并且Exendin-4能夠顯著降低高糖條件下F