叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1對高糖誘導(dǎo)下大鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)堆積的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、背景：
　　糖尿病腎?。―iabetes nephropathy，DN）是由糖尿病常見微血管并發(fā)癥。在DN發(fā)生發(fā)展過程中，腎小球系膜細(xì)胞(Mesangial cells，MCs)過度增殖功能紊亂，引起細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)蛋白分泌與降解相對失衡而過度堆積于腎小球系膜區(qū)及基底膜，導(dǎo)致腎小球形態(tài)和功能發(fā)生改變，最終促進(jìn)腎小球硬化癥的發(fā)生。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead transcript

2、ion factor,FoxO1)是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族中的一員，在對抗氧化應(yīng)激、調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)控增殖凋亡、調(diào)節(jié)蛋白分泌等方面發(fā)揮重要作用，其轉(zhuǎn)錄活性受磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)傳導(dǎo)通路負(fù)向調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型腎皮質(zhì)中，F(xiàn)oxO1的活性水平有所下降，伴隨以ECM相關(guān)蛋白表達(dá)升高。因此推測DN狀態(tài)下FoxO1活性水平的降低與ECM蛋白過度堆積可能存在一定聯(lián)系，但是FoxO1調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞

3、功能的具體機(jī)制尚不清楚。
　　高糖狀態(tài)下MCs合成并分泌ECM的過程，與轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)相關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1與TGF-β傳導(dǎo)通路存在交互關(guān)系。在HepG2細(xì)胞中，過表達(dá)FoxO1能夠?qū)筎GF-β1引起的PAI-1（Plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）水平的升高，后者能夠抑制纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)變，減少ECM降

4、解。因此推測，系膜細(xì)胞中FoxO1與TGF-β傳導(dǎo)通路的交互作用，可能對ECM堆積產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)以組成性激活突變型(Constitutively active，CA)FoxO1過表達(dá)慢病毒載體上調(diào)MCs中FoxO1的表達(dá)及活性，觀察FoxO1對ECM相關(guān)蛋白堆積及TGF-β/Smad傳導(dǎo)通路的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　目的：
　　觀察慢病毒載體介導(dǎo)的組成性激活突變型FoxO1過表達(dá)對于高糖培養(yǎng)下系膜細(xì)胞中TGF-β/

5、Smad傳導(dǎo)通路的激活及ECM堆積的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：
　　將本課題組構(gòu)建的含組成性激活突變型（Constitutively active，CA）FoxO1編碼序列的慢病毒載體（LV-CA-FoxO1）及空慢病毒載體(LV-NC-GFP)，轉(zhuǎn)染于正常糖濃度(5.6mmol/L)培養(yǎng)的MCs。將未轉(zhuǎn)染的MCs分為正常糖濃度組(NG組)和單純高糖(25mmol/L)組（HG組），將轉(zhuǎn)染后的MCs培養(yǎng)于高糖

6、(25mmol/L)環(huán)境下分為LV-CA-FoxO1組（LV-CA組）和空病毒載體組(LV-NC組)。各組處理72h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測各組FoxO1、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅰ型膠原蛋白(TypeⅠCollagen，ColⅠ)、纖溶酶原激活物抑制物1（Plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）、TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體(TGF-βtyp

7、eⅠreceptor，TGF-βRⅠ)、轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體(TGF-βtypeⅡreceptor，TGF-βRⅡ)、Smad3蛋白、Smad7蛋白mRNA的表達(dá)水平;Western blotting法檢測PAI-1、FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、TGF-β1、TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、Smad7的蛋白水平;細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法檢測TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、S

8、mad3、p-Smad3的表達(dá)及分布;免疫共沉淀檢測Smad3與CBP蛋白(CREB-Bindingprotein，CBP)結(jié)合的改變。
　　結(jié)果：
　　1.LV-CA-FoxO1能夠有效提高FoxO1表達(dá)及活性:與NG組相比，HG組p-FoxO1水平升高(P＜0.05)，轉(zhuǎn)錄活性下降;LV-CA組FoxO1、p-FoxO1蛋白水平均有所增加(P＜0.05)，但p-FoxO1/FoxO1水平下降，F(xiàn)oxO1表達(dá)增加，活性增強(qiáng)

9、。
　　2.FoxO1過表達(dá)減少ECM堆積:與NG組相比，HG組FN、ColⅠ、PAI-1的表達(dá)水平均有所升高(均P＜0.05)，ECM分泌增加降解減少;與HG組相比，LV-CA組FN、ColⅠ、PAI-1的mRNA及PAI-1蛋白水平均有所下降(均P＜0.05)，ECM堆積得到改善。
　　3.FoxO1過表達(dá)減少TGF-β傳導(dǎo)通路激活:與NG組相比，HG組TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡmRNA及蛋白水平升高（

10、均P＜0.05）;與HG組相比，LV-CA組TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡmRNA及蛋白水平下降（均P＜0.05），細(xì)胞免疫熒光化學(xué)提示TGF-βRⅠ及TGF-βRⅡ在細(xì)胞內(nèi)分布減少。
　　4.FoxO1過表達(dá)不影響Smad3蛋白表達(dá)，影響其磷酸化水平:Smad3是一種受體調(diào)節(jié)型Smad蛋白（Receptor-regulated Smad，R-Smad），能夠促進(jìn)ECM蛋白及PAI-1分泌。與NG組相比，HG組Sma

11、d3蛋白及p-Smad3蛋白水平增加;與HG組相比，LV-CA組Smad3蛋白表達(dá)無變化(P＞0.05)，p-Smad3水平降低(P＜0.05)。
　　5.FoxO1過表達(dá)抑制R-Smad蛋白轉(zhuǎn)錄活性:IF結(jié)果顯示，HG組的Smad3及p-Smad3積聚于細(xì)胞核內(nèi)，而LV-CA組Smad3和p-Smad3核質(zhì)分布均勻。CO-IP顯示HG組Smad3與CBP結(jié)合增加(P＜0.05);而LV-CA組Smad3與CBP結(jié)合減弱(P＜0.

12、05)。HG組Smad3轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，LV-CA組則減弱。
　　6.FoxO1過表達(dá)上調(diào)Smad7表達(dá):Smad7蛋白是一種抑制性Smad蛋白(InhibitorySmad，I-Smad)，能夠抑制TGF-β/Smad通路激活。相比于NG組，HG組Smad7蛋白及mRNA水平降低（均P＜0.05）;LV-CA組較HG組Smad7蛋白及mRNA水平增加(均P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.高糖能夠降低系膜細(xì)胞中Fox