叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1對高糖誘導(dǎo)下小鼠足細(xì)胞線粒體自噬的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：糖尿病腎病(DN)是一種糖尿病微血管并發(fā)癥，并且已經(jīng)成為糖尿病對生存率危害最大的并發(fā)癥之一。DN是導(dǎo)致終末期腎臟疾病(ESRD)的首要獨(dú)立病因。足細(xì)胞損傷在DN發(fā)病中被認(rèn)為是引起蛋白尿和腎小球硬化的關(guān)鍵。蛋白尿的產(chǎn)生主要是由于腎小球?yàn)V過屏障（GFB）的完整性受到破壞，進(jìn)而影響其選擇透過蛋白的功能。足細(xì)胞(Podocyte)是體內(nèi)一種高度分化的細(xì)胞，定位于腎小球基底膜外側(cè)，其胞體可伸出較自身長度數(shù)倍的一級和次級足突，包繞腎小球，相鄰

2、足突之間的直徑為30-40nm的間隙又被滲透性裂孔隔膜(SD)所填充。作為腎小球?yàn)V過屏障的最后一層結(jié)構(gòu)，足細(xì)胞及SD的完整性對維持腎小球?yàn)V過功能具有重要作用。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead transcriptionfactor，F(xiàn)oxO1)屬于叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族，在調(diào)控細(xì)胞抗氧化應(yīng)激、靜止/進(jìn)入細(xì)胞周期、凋亡、增殖、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝及自噬等多種病理生理過程，也在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。研究表明，在使用STZ模

3、擬的的DN鼠腎臟皮質(zhì)中，F(xiàn)oxO1的轉(zhuǎn)錄活性呈抑制狀態(tài)。在真核細(xì)胞內(nèi)，線粒體是有氧代謝活動發(fā)生的主要場所，因此也是細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生的主要部位。在正常生理狀況下，細(xì)胞可通過包括線粒體自噬（mitophagy）在內(nèi)的一系列途徑清除受損或衰老線粒體，以維持細(xì)胞內(nèi)ROS含量的穩(wěn)定。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）誘導(dǎo)的激酶1（PTEN induced putative kinase1，PINK1）是細(xì)胞在氧

4、化應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)生成的一種促生存因子，是參與調(diào)節(jié)線粒體自噬的重要功能蛋白之一，在高糖培養(yǎng)下的足細(xì)胞中表達(dá)量下降。有研究表明，在心肌細(xì)胞中PINK1可以作為FoxO1下游基因，參與氧化應(yīng)激刺激中細(xì)胞的生存調(diào)節(jié)。DN發(fā)生時(shí)，F(xiàn)oxO1的腎臟保護(hù)作用是否也與活化PINK1，繼而調(diào)節(jié)線粒體自噬，減少ROS過度生成有關(guān)，目前尚需進(jìn)一步研究提供證據(jù)。
　　目的：觀察FoxO1對高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞線粒體自噬和線粒體功能的影響及作用機(jī)制。

5、>　　方法：構(gòu)建含組成性激活突變型（Constitutively active，CA）和短發(fā)夾RNA（shRNA） FoxO1編碼序列的慢病毒載體（LV-CA-Fox01、LV-shFoxO1）、PINK1短發(fā)夾RNA（LV-shPINK1）及空慢病毒載體（LV-NC）。36只SPF級雄性 KM小鼠，隨機(jī)選取其中27只使用STZ誘導(dǎo)構(gòu)建DN模型，9只作為正常對照組（NG組）。造模成功后，將成模鼠隨機(jī)分為3組：糖尿病組（DM組），糖尿病

6、CA-FoxO1轉(zhuǎn)染組（CA組）和糖尿病空病毒轉(zhuǎn)染組（NC組）。小鼠麻醉后，在解剖顯微鏡下右側(cè)腎皮質(zhì)點(diǎn)注射 CA-FoxO1慢病毒載體及空慢病毒載體（LV-NC）10μl×3處。于病毒注射后12周末，尾靜脈取血測血糖后麻醉小鼠，迅速剝離出腎臟，置于4％多聚甲醛中固定用于 HE檢查，于4%預(yù)冷戊二醛固定用于電子顯微鏡檢查。新鮮腎臟于液氮中冷凍，qRT-PCR檢測腎皮質(zhì)中FoxO1mRNA水平，蛋白免疫印跡法檢測各組腎皮質(zhì)中FoxO1、p-

7、FoxO1、PINK1、parkin、p62、MFN2蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在正常糖濃度(5.6mmol/L)培養(yǎng)基中的條件永生性小鼠足細(xì)胞（Conditionally immortalized mouse podocyte cell line,CIMPs）。將細(xì)胞按不同培養(yǎng)環(huán)境及處理分為：①正糖對照組（NG，5.6mmol/L）；②單純高糖組（HG，25mmol/L）；③ FoxO1上調(diào)組（HG+LV-CA-FoxO1）；④雙轉(zhuǎn)染組（HG

8、+LV-CA-FOxO1+LV-shRNA-PINK1）；⑤ HG+空慢病毒轉(zhuǎn)染組（HG+LV-NC）；⑥正常糖+FoxO1下調(diào)組（NG+LV-shRNA-FoxO1）。各組處理72h后，qRT-PCR檢測①-③及⑥組FoxO1mRNA表達(dá)水平，蛋白免疫印跡法檢測①-⑤組PINK1、Parkin、MFN2、p62蛋白表達(dá)水平；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測①-③及⑥組 FoxO1蛋白分布情況；染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）法檢測 FoxO1與PIN

9、K1啟動子的結(jié)合情況；透射電鏡觀察①-⑤組線粒體及自噬體；激光共聚焦顯微鏡觀察①-⑤組腺病毒載體介導(dǎo)的GFP-LC3與線粒體熒光探針共定位觀測線粒體自噬水平；流式細(xì)胞儀結(jié)合DCFH-DA熒光探針法檢測①-⑤組ROS的生成率，JC-1試劑盒測①-⑤組細(xì)胞線粒體膜電位。
　　結(jié)果：⑴在DN模型鼠腎皮質(zhì)中，慢病毒轉(zhuǎn)染可上調(diào) FoxO1表達(dá)：與 NC組相比，DM組FoxO1 mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而CA組FoxO1

10、mRNA水平較DM組明顯上升(P<0.05)，p-FoxO1/FoxO1比值明顯下降(P<0.05)表示高糖可以誘導(dǎo)FxoO1轉(zhuǎn)錄活性下降。⑵上調(diào)FoxO1轉(zhuǎn)錄活性可以增加PINK1/parkin途徑相關(guān)蛋白表達(dá)量，減緩小鼠DN進(jìn)展：蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，CA組PINK1、parkin和MFN2蛋白表達(dá)量明顯高于DM組(P<0.05)，p62蛋白相對表達(dá)量明顯低于DM組(P<0.05)。HE和掃描電鏡染色顯示CA組足突損失、足突融合等病

11、變均較DM組有所減輕。⑶轉(zhuǎn)染CA-FoxO1可有效提高CIMPs中FoxO1表達(dá)水平：與①組相比，②組FoxO1mRNA水平無明顯改變(P>0.05)，同②組相比，③組FoxO1mRNA相對表達(dá)量有所增加(P<0.05)。同樣，⑥組同①組相比，F(xiàn)oxO1mRNA水平明顯下降(P<0.05)，說明轉(zhuǎn)染sh-FoxO1可以顯著降低FoxO1整體表達(dá)水平。⑷染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示，在正常糖培養(yǎng)的CIMPs中，F(xiàn)oxO1可以同PINK1的啟動

12、子區(qū)域結(jié)合，高糖環(huán)境可以顯著抑制這一行為（P<0.05）。⑸與①組相比，高糖明顯降低足細(xì)胞中PINK1、Parkin、MFN2的蛋白表達(dá)水平（P<0.05），升高p62的蛋白表達(dá)（P<0.05）；③組同①相比，轉(zhuǎn)染CA-FoxO1可顯著抑制高糖對上述指標(biāo)的影響（P<0.05）；在④組中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻斷（P<0.05）。⑹與①組相比，高糖處理和轉(zhuǎn)染 FoxO1-shRNA均可明顯減少足細(xì)胞核內(nèi)FoxO1熒

13、光強(qiáng)度（P<0.05）；③組同①相比，轉(zhuǎn)染CA-FoxO1可顯著抑制高糖的影響（P<0.05）；在④組中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻斷（P<0.05）。⑺與①組相比，高糖可以明顯降低足細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位（P<0.05）；③組同①相比，轉(zhuǎn)染CA-FoxO1可顯著提高線粒體膜電位（P<0.05）；在④組中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻斷（P<0.05）。⑻與①組相比，高糖明顯升高足細(xì)胞中ROS水平（P

14、<0.05）；③組同①相比，轉(zhuǎn)染 CA-FoxO1可顯著抑制高糖的影響（P<0.05）；在④組中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻斷（P<0.05）。⑼透射電鏡結(jié)果顯示，與①組相比，高糖環(huán)境中的足細(xì)胞線粒體水腫、嵴斷裂增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象嚴(yán)重。上調(diào) FoxO1后上述現(xiàn)象有所減輕，在此基礎(chǔ)上下調(diào)PINK1后，不能觀察到明顯的損傷改善。⑽激光共聚焦顯微鏡所拍攝照片顯示，與①組相比，高糖環(huán)境下培養(yǎng)的足細(xì)胞紅綠融合斑點(diǎn)數(shù)量減