叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1對(duì)糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，其常見的臨床特征為進(jìn)行性蛋白尿，腎臟足細(xì)胞損傷是引起蛋白尿的關(guān)鍵靶點(diǎn)。足細(xì)胞位于腎小球毛細(xì)血管外的基底膜外層。以往研究表明，足突分離和足細(xì)胞凋亡導(dǎo)致蛋白尿，但是，近期有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白尿發(fā)生明顯早于足細(xì)胞脫落凋亡。Liu等提出，在損傷早期，足細(xì)胞可經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelia mesenchymal transition，EMT），

2、使足細(xì)胞具有運(yùn)動(dòng)性，而從基底膜脫落，使濾過屏障受到破壞。Sam認(rèn)為，足細(xì)胞經(jīng)歷EMT為一動(dòng)態(tài)過程，從中阻斷其介導(dǎo)通路可逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞EMT，及時(shí)終止足細(xì)胞損傷，從而為早期防治蛋白尿的發(fā)生，緩解糖尿病腎病進(jìn)程提供新的方向。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(FoxO1）在轉(zhuǎn)錄翻譯、抗氧化應(yīng)激、糖脂代謝等方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)DN大鼠腎皮質(zhì) FoxO1，可緩解腎小球病變，包括系膜細(xì)胞和足細(xì)胞損傷。高糖環(huán)境下，TGF-β/Smad信號(hào)通路激

3、活，介導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白nephrin表達(dá)降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin表達(dá)升高，腎小球?yàn)V過屏障完整性受到破壞，進(jìn)而出現(xiàn)蛋白尿，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，在腎小管上皮細(xì)胞中，TGF-β/Smad/ILK激活促進(jìn)小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細(xì)胞中上調(diào)FoxO1，可抑制TGF-β通路，減少高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞過度合成細(xì)胞外基質(zhì)。然而，在不同細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1對(duì) TGF-β通路的影

4、響因細(xì)胞種類而異。因此，本研究推測(cè)，在小鼠足細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1可能通過抑制TGF-β/Smad/ILK信號(hào)通路過度激活，減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT，從而緩解糖尿病腎病腎臟足細(xì)胞損傷。
　　目的：研究FoxO1對(duì)糖尿病腎病小鼠和高糖下足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化及TGF-β/Smad/ILK傳導(dǎo)通路的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法：使用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，將組成性激活突變型（Constitutively active，CA） Fo

5、xO1慢病毒載體（LV-CA-FoxO1）、FoxO1短發(fā)夾樣 RNA慢病毒載體（LV-FoxO1-shRNA）及空慢病毒載體（LV-NC）轉(zhuǎn)染入足細(xì)胞，并使用藥物干預(yù)TGF-β通路。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組為正常糖濃度組（NG組）和單純高糖（25mmol/L）組（HG組），將轉(zhuǎn)染LV-CA-FoxO1和LV-NC的足細(xì)胞培養(yǎng)于高糖（25mmol/L）環(huán)境下分為 LV-CA-FoxO1組（CA組）和空病毒載體組（NC組），將轉(zhuǎn)染LV-FoxO1-s

6、hRNA的足細(xì)胞分為L(zhǎng)V-FoxO1-shRNA組（shRNA組）和分別使用藥物SIS3及QLT0267處理后分為SIS3組和QLT組。各組分別高糖處理72h、藥物處理12h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)各組FoxO1、TGF-β1、Smad3、ILK、nephrin、desmin mRNA的表達(dá)水平；Western blotting法檢測(cè)FoxO1、磷酸化FoxO1（p-FoxO1）、TGF-β1、Smad3

7、、磷酸化Smad3（p-Smad3）、ILK、nephrin、desmin的蛋白水平；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)FoxO1的表達(dá)及分布，酶聯(lián)免疫法（Elisa法）檢測(cè)上清中TGF-β1的分泌量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：通過STZ誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠動(dòng)物模型，使用靶向注射的方法將LV-CA-FoxO1及LV-NC注射入小鼠右側(cè)腎皮質(zhì)。糖尿病小鼠隨機(jī)分為3組：糖尿病未治療組（DM組），LV-CA-FoxO1治療組（CA組）及LV-NC組（NC組），以正常小

8、鼠作為正常對(duì)照組（NG組）。8周末取材，抽取小鼠內(nèi)眥靜脈檢測(cè)血清肌酐、尿素氮；收集隨機(jī)尿檢測(cè)尿微量白蛋白和24小時(shí)尿檢測(cè)24小時(shí)尿總蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)FoxO1、TGF-β1、Smad3、ILK、nephrin、desmin mRNA的表達(dá)水平；Western blotting法檢測(cè)FoxO1、磷酸化FoxO1（p-FoxO1）、TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、ILK、nephrin、des

9、min的蛋白水平；免疫組化檢測(cè)腎小球nephrin和desmin表達(dá)水平；HE染色及掃描、透射電鏡觀察腎臟病理學(xué)變化情況。
　　結(jié)果：⑴各組FoxO1表達(dá)及活性改變：在各組足細(xì)胞中，與NG組相比，HG組、NC組FoxO1 mRNA及蛋白表達(dá)無明顯變化（P>0.05），CA組較HG組FoxO1 mRNA及蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。HG組較 NG組 p-FoxO1/FoxO1水平升高（P<0.05），轉(zhuǎn)錄活性下降；CA組 p-Fo

10、xO1/FoxO1水平降低（P<0.05），與NG組相比，shRNA組、SIS3組QLT組FoxO1 mRNA及蛋白表達(dá)減少（均P<0.05），p-FoxO1/FoxO1無變化（P>0.05）。在足細(xì)胞細(xì)胞免疫熒光中NG組、HG組和NC組總紅色熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），與 NG組相比，HG組細(xì)胞核中FoxO1紅色熒光減弱，胞質(zhì)中相對(duì)增多（均P<0.05）。與HG組相比，CA組細(xì)胞總紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，核中與細(xì)胞總熒光強(qiáng)度比值增

11、加（均P<0.05）。與 NG組相比，shRNA組總紅色熒光強(qiáng)度減弱，胞核與細(xì)胞總紅色熒光強(qiáng)度比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05）。⑵FoxO1對(duì) TGF-β1/Smad3/ILK信號(hào)通路的影響：與 NG組相比，HG組TGF-β1、Smad3和ILK mRNA及蛋白表達(dá)均升高（均P<0.05）。與HG組相比，CA組TGF-β1和ILK mRNA及蛋白表達(dá)減少，p-Smad3/Smad3升高（均P<0.05），而Smad3 mRNA及蛋白表

12、達(dá)無差異（P>0.05）；相比較NG組，shRNA組中TGF-β1、Smad3和ILK mRNA及蛋白表達(dá)均升高，且p-Smad3/Smad3增大（均P<0.05）。與shRNA組相比，SIS3組p-Smad3/Smad3降低，且ILK mRNA及蛋白表達(dá)減少（均P<0.05），而QLT組僅表現(xiàn)為ILK表達(dá)減少（P<0.05），通路中其他指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05）。⑶FoxO1對(duì)足細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白nephrin及間質(zhì)標(biāo)志蛋白de

13、smin的影響：HG組與NG組相比，nephrin mRNA及蛋白表達(dá)降低，desmin mRNA及蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；與HG組相比，CA組nephrin mRNA及蛋白表達(dá)升高，desmin mRNA及蛋白表達(dá)降低（均P<0.05）。與NG組相比，shRNA組nephrin mRNA及蛋白表達(dá)降低，desmin mRNA及蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。與shRNA組相比，SIS3組和Q

14、LT組nephrin mRNA及蛋白表達(dá)升高，desmin mRNA及蛋白表達(dá)降低（均P<0.05）。NC組與HG組nephrin、desmin mRNA及蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05）。⑷各組小鼠腎小球FoxO1表達(dá)：在NG、DM和NC組小鼠腎小球中FoxO1 mRNA和蛋白無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），CA組中FoxO1 mRNA和蛋白表達(dá)增多（P<0.05）。與NG組相比，DM組p-FoxO1/FoxO1比值升高（P<0.

15、05）。與DM組相比，CA組p-FoxO1/FoxO1比值降低（P<0.05）。⑸各組小鼠腎小球中FoxO1抑制 TGF-β1/Smad3/ILK信號(hào)通路的激活：與NG組相比，DM組TGF-β1、Smad3和ILK mRNA和蛋白表達(dá)增多，p-Smad3/Smad3比值增大（均P<0.05），TGF-β1/Smad3/ILK信號(hào)通路激活。與DM組相比，CA治療組TGF-β1和ILK mRNA和蛋白表達(dá)減少（均P<0.05），Smad3

16、mRNA和蛋白表達(dá)無變化（P>0.05），但是p-Smad/Smad3比值降低（P<0.05）。⑹FoxO1緩解糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞EMT：與NG組相比，DM組上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin mRNA及蛋白表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin mRNA及蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P<0.05）；與 DM組相比，CA治療組nephrin mRNA及蛋白表達(dá)升高，desmin mRNA及蛋白表達(dá)降低（均P<0.05）。免疫組化結(jié)

17、果顯示，在糖尿病小鼠腎臟腎小球中，nephrin表達(dá)減少，desmin表達(dá)增多（均 P<0.05），而經(jīng) LV-CA-FoxO1治療后，nephrin表達(dá)增多，desmin表達(dá)減少（均P<0.05）。⑺FoxO1過表達(dá)緩解糖尿病小鼠腎臟損傷：與NG組比較，糖尿病未治療組及LV-CA-FoxO1、LV-NC治療組血糖水平明顯升高。8周末，DM組血清肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白、24 h尿蛋白水平較NG組明顯升高（均P<0.05），CA治療后

18、血清肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白、24 h尿蛋白水平明顯降低（均P<0.05）。HE染色光鏡觀察顯示NG組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)整齊，無明顯異常。DM組小鼠腎小球體積明顯增大，基底膜異常增厚。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示NG組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，基底膜均勻，無增厚，足細(xì)胞胞體飽滿，足突排列整齊，DM組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，且厚薄不均一，足細(xì)胞胞體足突融合、缺失。
　　結(jié)論：①高糖下足細(xì)胞FoxO1轉(zhuǎn)錄活性降低，導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。②過