大黃酸對(duì)糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與MMP-9-TIMP-1的影響.pdf

1、背景及目的: 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是引起慢性腎功能衰竭的主要病因之一。腎小管間質(zhì)病變是包括糖尿病腎病(Diabeticnephropathy，DN)在內(nèi)的慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展為終末期腎臟病(End-stage renal disease，ESRD)的共同病理基礎(chǔ)，其核心特征是腎間質(zhì)纖維化，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matri

2、x，ECM)在腎間質(zhì)過量堆積是腎間質(zhì)纖維化基本病理特征。目前認(rèn)為ECM主要由肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MyoF)分泌，MyoF是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要效應(yīng)細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)在病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-myofibroblast transdifferentiation，EMT)，即喪失原有的上皮細(xì)胞表型特征，而獲得MyoF的新特征。有文獻(xiàn)報(bào)道，皮質(zhì)中至少36％的My

3、oF來源于腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，是腎間質(zhì)MyoF的重要來源之一。基底膜是腎小管的重要結(jié)構(gòu)之一，其不僅是腎小管上皮細(xì)胞的支撐結(jié)構(gòu)，同時(shí)也影響著腎小管上皮細(xì)胞的行為，如維持正常狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞的上皮型表型?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)是一類肽鏈內(nèi)切酶的統(tǒng)稱，其中MMP-9又稱明膠酶B，主要降解IV型纖維，其裂解基底膜使得轉(zhuǎn)分化而來的細(xì)胞進(jìn)入腎臟間質(zhì)是EMT關(guān)鍵步驟之一。另外，MMP-9與其

4、特異性抑制物基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(Tissue inhibitor of metallopr-oteinases-1，TIMP-1)共同調(diào)節(jié)ECM的降解，MMP-9表達(dá)減少或活性下降、TIMP-1表達(dá)增加、活性增強(qiáng)都將促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)MMP-9/TIMP-1較穩(wěn)定，能夠反映腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度。 大黃(Rhubarb)是臨床上治療慢性腎臟病常用的中藥，能有效減緩慢性腎臟病進(jìn)程，具有肯定的腎臟保護(hù)作用

5、，其延緩CKD進(jìn)展的作用與其蒽醌類化合物有著密切的關(guān)系。研究表明該類化合物能夠抑制鏈脲菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟肥大以及系膜細(xì)胞的增殖、間質(zhì)成纖維細(xì)胞的激活等。大黃酸(Rhein)是大黃蒽醌類化合物中主要組分之一，為大黃的主要有效成分。但大黃酸對(duì)DN的保護(hù)作用，是否涉及抑制EMT的進(jìn)程及通過影響MMP-9/TIMP-1的改變減少ECM的積聚、減輕間質(zhì)纖維化，尚少見報(bào)道。 本研究以STZ大鼠腹腔注射建立糖尿病模型，HE、M

6、asson染色分別評(píng)價(jià)腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)和腎間質(zhì)膠原相對(duì)面積，免疫組化法檢測(cè)反映上皮細(xì)胞表型特征的E-鈣粘素(E-Cadherin)、反映MyoF表型特征的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和影響ECM積聚的MMP-9、TIMP-1等指標(biāo)，觀察在DN小管間質(zhì)病變中，是否發(fā)生EMT以及MMP-9/TIMP-1的變化；用大黃酸干預(yù)處理，纈沙坦干預(yù)作為陽性對(duì)照，觀察EMT、MMP-9/TIMP-1與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系以及上述兩種藥物對(duì)其的影

7、響，比較大黃酸、纈沙坦的療效有無差別，探討大黃酸的腎臟保護(hù)機(jī)制。 方 法: 48只雄性Wistar大鼠分別為正常對(duì)照組(對(duì)照組，n=12)、糖尿病模型組(糖尿病組，n=12)、糖尿病大黃酸干預(yù)組(大黃酸組，n=12)和糖尿病纈沙坦干預(yù)組(纈沙坦組，n=12)。采用腹腔內(nèi)一次性注射STZ55mg.kg-1建立糖尿病大鼠模型。成模后，分別給予干預(yù)組大鼠大黃酸100mg.kg-1.d-1、纈沙坦組30mg.kg-1.d-1灌

8、胃。分別于第8、16周末，留24小時(shí)尿測(cè)定24小時(shí)尿蛋白排泄量；然后每組隨機(jī)選取6只大鼠，心臟取血測(cè)血肌酐(SCr)、血甘油三酯(TG)和膽固醇(CHO)：腎臟原位灌洗后，取腎組織：做石蠟切片，HE染色觀察腎小管間質(zhì)病變；Masson染色觀察腎間質(zhì)纖維化；石蠟切片免疫組化法檢測(cè)腎臟E-Cadherin、α-SMA及MMP-9、TIMP-1的表達(dá)。 結(jié)果: 1.糖尿病組、大黃酸組、纈沙坦組大鼠的24小時(shí)尿蛋白量、血肌酐與腎

9、小管間質(zhì)損傷指數(shù)、間質(zhì)膠原相對(duì)面積等均隨病程進(jìn)展而增加，明顯高于同期對(duì)照組(P<0.01)；大黃酸、纈沙坦干預(yù)后，能夠降低24小時(shí)尿蛋白量、血肌酐，減輕腎小管間質(zhì)損傷，降低腎間質(zhì)膠原面積。16周時(shí)大黃酸組、纈沙坦組較同期糖尿病組，腎臟保護(hù)作用更加顯著(P<0.01)，大黃酸組與纈沙坦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.糖尿病組、大黃酸組、纈沙坦組大鼠腎小管上皮細(xì)胞E-Cadherin表達(dá)隨病程逐漸減少(P<0.05)，而α-SMA、

10、MMP-9表達(dá)逐漸增加，MMP-9/TIMP-1比值逐漸下降，均較同期對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)：大黃酸、纈沙坦組下降的E-Cadherin逐漸上調(diào)、α-SMA、MMP-9下調(diào)、MMP-9/TIMP-1比值恢復(fù)，16周時(shí)大黃酸組、纈沙坦組較同期糖尿病組各指標(biāo)的改善有顯著差異(P<0.01)，大黃酸干預(yù)效果與纈沙坦比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1.糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)升高、腎間質(zhì)膠原面積增加，腎小管上皮細(xì)

11、胞E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)增加，表明DN腎小管間質(zhì)病變進(jìn)程中，存在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)，是糖尿病腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。 2.糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞MMP-9不適當(dāng)?shù)母弑磉_(dá)裂解腎小管基底膜，促進(jìn)EMT的發(fā)生，而且MMP-9/TIMP-1比值隨病變進(jìn)展逐漸下降，腎間質(zhì)ECM積聚，表明MMP-9/TIMP-1比值失衡是糖尿病腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的一個(gè)重要因素。 3.大黃酸可降低糖尿病大