白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎臟叉頭轉(zhuǎn)錄因子01的影響及機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一,是引起終末期腎功能衰竭的主要因素。目前其發(fā)生機制尚不完全清楚。近年來大量研究表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)是糖尿病血管并發(fā)癥及糖尿病本身發(fā)生發(fā)展的一個主要因素,其與DN的關系尤為密切[1]。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Ol(Forkhead transcription factor Ol,FoxOl

2、)是Fox蛋白家族中的一員,其可通過上調(diào)抗氧化靶基因的水平,如,過氧化氫酶(catalase,CAT),起到抗氧化應激的作用[2]。
　　 沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Sir2,哺乳動物為Sirtl)是細胞應激時FoxO乙酰化和轉(zhuǎn)錄功能的重要調(diào)節(jié)子[3]。Sirtl／FoxOl通路對糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的影響國內(nèi)外尚無報道,此通路對糖尿病腎臟是否起保護作用有待探討。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是目前發(fā)現(xiàn)的最強的Sirtl激活

3、劑[4],其可使Sirtl的表達增加。本實驗應用白藜蘆醇治療實驗性糖尿病大鼠,探討白藜蘆醇／Sirtl／FoxOl／CAT通路對糖尿病大鼠腎臟的保護作用,進一步研究DN發(fā)生發(fā)展的機制。
　　 材料與方法：
　　 健康、雄性清潔級SD大鼠42只,體重(220±20)g,隨機選取32只大鼠建立糖尿病(DM)模型,其余10只大鼠作為正常對照組(A組)。DM大鼠造模方法如下:禁食12h后,按60mg／kg一次性大劑量腹腔注射1％

4、STZ溶液,A組注射相當體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。72h后測定血糖(BG)≥16.7mmol／L,為DM成模標準(4只失敗)。將糖尿病鼠再隨機分為糖尿病未治療組(B組)和糖尿病白藜蘆醇治療組(C組)。自成模之日起,C組每日固定時間以白藜蘆醇混懸液30mg／kg,1次／日,灌胃12周。A、B組給予相同劑量的生理鹽水。各組大鼠自由進食飲水,實驗中不予任何降血糖藥物。實驗第12周末,代謝籠收集24小時尿,離心,保存于4℃冰箱,測定24小時

5、尿蛋白(UPro／24h)及尿白蛋白定量(UAIb)。麻醉后腹腔靜脈取血,分離血清檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。剝離雙腎,右腎稱重后取腎皮質(zhì)置于4％多聚甲醛中固定,光鏡觀察腎小球病理學變化,免疫組化檢測大鼠腎小球膠原Ⅳ、纖連蛋白表達水平；取左腎上極1mm3大小的組織塊,迅速用4％冷戊二醛溶液固定,透射電子顯微鏡觀察腎臟超微結(jié)構變化,剩余腎皮質(zhì)迅速置于-70℃冰箱里,分光光度計檢測腎皮質(zhì)丙二醛(MDA)含量和總超氧化物歧化酶(S

6、OD)活性,RT-PCR檢測腎皮質(zhì)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtl)、FoxOl、過氧化氫酶(CAT)mRNA表達水平,Western blot檢測FoxOl蛋白及其磷酸化的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.實驗12周末,與正常對照組比較,糖尿病未治療組BG(28.2±2.7)mmol／L、KI(8.1±0.8)×10-3、UPro／24h(26.8±4.1)mg／24h、UAIb(0.89±0.13)mg／24h、Scr(

7、73.5±10.9)μmol／L和BUN(15.3±1.4)mmol／L水平顯著升高(均P<0.05),BW(250±27)g水平明顯降低(P<0.05)；與糖尿病未治療組比較,白藜蘆醇治療組KI(5.2±0.5)×10-3、Upro／24h(16.9±2.6)mg／24h、UAIb(0.65±0.11)mg／24h、Ser(56.7±5.9)μmol／L和BUN(11.3±1.1)mmol／L水平明顯降低(均P<0.05),但仍高于正

8、常對照組(P<0.05),BG(27.8±3.3)mmol／L水平稍有下降、BW(271±31)g水平稍有上升,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 2.糖尿病未治療組腎皮質(zhì)MDA含量(3.47±0.24)nmol／mg prot比正常對照組(1.35±0.29)nmol／mg prot明顯升高(P<0.05),腎皮質(zhì)總SOD活性(23.51±7.79)U／mg prot較正常對照組(65.74±8.71)U／mg pro

9、t顯著降低(P<0.05)；與糖尿病未治療組相比,白藜蘆醇治療組腎皮質(zhì)MDA含量(2.48±0.27)nmol／mg prot顯著減少(P<0.05),總SOD活性(43.31±5.57)U／mg prot則明顯升高(P<0.05)。
　　 3.免疫組化結(jié)果顯示,與正常對照組比較(分別為1.09±0.11,1.81±0.44),糖尿病未治療組大鼠腎小球纖連蛋白(10.65±1.27)、膠原Ⅳ(20.11±1.28))表達水平升高

10、(均P<0.05)；白藜蘆醇治療組大鼠腎小球中兩者蛋白的表達水平(分別為6.26±1.04,10.08±1.01)較糖尿病未治療組均明顯降低(均 P<0.05),但仍高于正常對照組(P<0.05)。
　　 4.糖尿病未治療組大鼠腎皮質(zhì)Sirtl(0.63±0.04)、FoxOl(0.37±0.03)、CATmRNA(0.22±0.03)表達水平較正常對照組明顯降低(分別為0.96±0.08,0.69±0.05,0.48±0.04

11、:均P<0.05)；與糖尿病未治療組比較,白藜蘆醇治療組糖尿病大鼠腎皮質(zhì)三者的mRNA的表達水平顯著增加(分別為0.83±0.05,0.53±0.04,0.40±0.03；均P<0.05),但仍高于正常對照組(P<0.05)。
　　 5.糖尿病未治療組FoxOl磷酸化水平(2.15±0.08)較對照組(1.14±0.08)明顯升高,白藜蘆醇治療組FoxOl磷酸化水平(1.72±0.07)較糖尿病未治療組顯著降低(P<0.05),

12、但仍高于對照組(P<0.05)；FoxOl蛋白表達各組間比較無顯著性差異(分別為0.45±0.09,0.48±0.08,0.47±0.09:均P>0.05)。
　　 6.腎臟病理檢測顯示,光鏡HE染色顯示正常對照組大鼠腎小球結(jié)構未見異常,糖尿病未治療組大鼠腎小球體積增大,系膜細胞增生,腎小球系膜基質(zhì)增多,基底膜增厚。電鏡超微結(jié)構顯示正常對照組大鼠腎小球結(jié)構清晰,基底膜均勻無增厚,上皮細胞足突均勻分布,糖尿病未治療組大鼠腎小球基底

13、膜顯著增厚,厚薄不均,上皮細胞足突融合。白藜蘆醇治療組大鼠腎小球病理變化明顯改善,表現(xiàn)為系膜細胞增生程度降低,腎小球基底膜增厚程度減輕,足突融合減輕。
　　 結(jié)論：
　　 1.糖尿病大鼠腎臟中FoxOl mRNA水平降低,FoxOl蛋白磷酸化水平升高。糖尿病大鼠腎臟中FoxOl的抗氧化應激作用降低。
　　 2.白藜蘆醇增加糖尿病大鼠腎臟FoxOl mRNA表達,降低FoxOl蛋白磷酸化水平。
　　 3.白