MicroRNA-27a對糖尿病大鼠腎臟系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)堆積的影響及機制研究.pdf

1、糖尿病腎病（Diabetes nephropathy，DN）是一個主要的糖尿病微血管并發(fā)癥，是引起糖尿病患者慢性腎功能衰竭的最主要原因之一。DN病理變化主要包括系膜細胞異常增生及細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）過度堆積。在高糖狀態(tài)下，腎小球系膜細胞（Mesangial cells, MCs）功能紊亂，引起ECM蛋白分泌和降解相對失衡而大量堆積于系膜區(qū)及基底膜區(qū)，使腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生病理性變化，最終

2、導(dǎo)致腎小球硬化癥的發(fā)生。轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor-β, TGF-β）在MCs合成及分泌ECM的過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，高糖可激活MCs中TGF-β/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致膠原 IV、纖連蛋白等多種 ECM成分合成增加，并促進 PAI-1（Plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）表達，從而抑制ECM降解。但是，目前對導(dǎo)致系膜細胞損傷的確切機制

3、尚不十分清楚。
　　microRNAs（miRNAs）是由21-25個核苷酸組成的非編碼小RNAs，其可與靶基因 mRNA3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域（3′-untranslated region，3′UTR）結(jié)合，通過促進mRNA降解或阻斷蛋白翻譯調(diào)節(jié)靶基因表達，從而調(diào)控機體病理生理過程。miRNAs在細胞增殖，生長，分化及凋亡中發(fā)揮重要作用。miRNAs在不同的組織表達不同，且其表達的變化參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤、心血管疾病、糖

4、尿病、各種腎臟疾病等。近年大量研究表明，miRNAs與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腎臟特定 miRNAs改變可以多種方式促進疾病的進展，從纖維化通路的激活到腎臟解剖學(xué)結(jié)構(gòu)改變引起蛋白尿。microRNA-27a（ miRNA-27a，miR-27a）主要在腎臟，皮下脂肪，肺及心臟中表達，參與細胞周期、增殖及分化的調(diào)節(jié)。研究表明miRNA-27a在1型和2型糖尿病患者的血清中表達升高，并與空腹血糖水平有較高的相關(guān)性；Herrera等運用微陣列分

5、析發(fā)現(xiàn)在自發(fā)2型糖尿病大鼠脂肪組織及高糖培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細胞中 miRNA-27a表達明顯上調(diào)；此外研究發(fā)現(xiàn) DN患者血清中 miRNA-27a明顯升高，這些研究表明miRNA-27a在高糖環(huán)境下表達升高并且可能在糖尿病及 DN的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。但是，目前國內(nèi)外缺乏對miRNA-27a與DN腎小球MCs損傷的研究。
　　過氧化物酶體增殖體激活受體-γ（Peroxisome proliferator-activat

6、ed receptorγ， PPARγ）是核受體超家族成員之一，在調(diào)節(jié)腎小球系膜細胞增殖，細胞周期及糖尿病腎小球細胞外基質(zhì)合成及降解中發(fā)揮重要作用。大量研究表明，PPARγ水平增加能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞及糖尿病動物模型腎臟TGF-β1的表達，減少PAI-1水平，從而抑制ECM的聚集；并且PPARγ表達升高可改善高糖誘導(dǎo)的系膜細胞增殖和肥大。因此增加PPARγ表達可能阻止腎小球硬化。研究表明 PPARγ是 miRNA-27a的一

7、個潛在靶基因，其3′-UTR端包含一個保守的miRNA-27a結(jié)合位點。在低氧處理的人肺動脈內(nèi)皮細胞中，miRNA-27a表達升高并可直接與PPARγ3′-UTR結(jié)合，負性調(diào)節(jié)其mRNA和蛋白表達水平，導(dǎo)致細胞增殖增加；抑制miRNA-27a表達則可以明顯增加PPARγ表達，從而抑制細胞增殖。另外，miRNA-27a可通過靶向結(jié)合PPARγ3′-UTR調(diào)節(jié)抑制脂肪細胞分化。因此我們推測，miRNA-27a可能通過調(diào)節(jié)腎臟PPARγ水平影

8、響系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)堆積，為此，本實驗開展以下研究。
　　第一部分 miRNA-27a在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞及糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中的表達研究
　　目的：
　　觀察高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞及糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中 miRNA-27a的表達，初步探討miRNA-27a與系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)堆積的關(guān)系。
　　方法:
　　1．高濃度葡萄糖（25 mmol/L, HG）分別刺激大鼠腎小球系膜細胞（MCs）24

9、、48、72 h，以葡萄糖濃度（5.6 mmol/L, NG）培養(yǎng)的MCs為正常對照組，TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測系膜細胞miRNA-27a水平。
　　2．8周齡SPF級健康雄性SD大鼠，體重為（220±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。構(gòu)建糖尿?。―M）動物模型，方法如下：禁食12 h后，1％鏈脲佐菌素（STZ）溶液按60 mg/kg一次性腹腔注射大鼠，正常（Control）組腹腔注射相當(dāng)體積檸檬酸緩沖液，72 h后檢測血糖

10、（Blood Glucose，BG）水平，以連續(xù)3次BG≥16.7 mmol/L為DM成模標準。分別于4、8、12周末，麻醉動物，剝離腎臟，取腎上極約1mm3大小腎皮質(zhì)迅速于4%預(yù)冷戊二醛中固定用于透射電鏡觀察；另取部分腎皮質(zhì)組織置于4%多聚甲醛內(nèi)固定用于免疫組化檢測及 HE染色光鏡觀察；其余腎皮質(zhì)組織快速置于液氮中，TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測系膜細胞miRNA-27a水平。
　　結(jié)果:
　　1．與正常糖培養(yǎng)的M

11、Cs相比，miRNA-27a在高糖培養(yǎng)的MCs中的表達明顯升高，并呈時間依賴性模式（P<0.05）。
　　2．與正常對照組相比，糖尿病大鼠腎皮質(zhì)miRNA-27a表達水平明顯升高，并呈時間依賴性模式（P<0.05）。
　　3．腎臟組織病理學(xué)檢測結(jié)果：HE染色光鏡觀察顯示Control組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)未見明顯異常，DM組大鼠腎小球體積明顯增大，系膜細胞異常增生，腎小球系膜基質(zhì)明顯增多，基底膜異常增厚。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示Con

12、trol組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰可見，基底膜無增厚，足細胞足突分布均勻，DM組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，且厚薄不均一，足細胞足突逐漸融合、缺失。糖尿病大鼠腎臟上述病理變化隨糖尿病病程的延長而加劇。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn) DM組大鼠腎小球ECM蛋白如膠原IV、纖連蛋白表達較Control組明顯升高（P<0.05），并呈時間依賴性模式。
　　結(jié)論:
　　miRNA-27a在高糖培養(yǎng)的腎小球MCs及STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中表達明顯升高

13、；miRNA-27a表達的上調(diào)同時伴有腎臟肥大及系膜外基質(zhì)堆積的增加，提示miRNA-27a可能和系膜細胞損傷有關(guān)。
　　第二部分調(diào)節(jié)miRNA-27a對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞PPARγ的影響研究
　　目的:
　　探討miRNA-27a對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞PPARγ的靶向調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　體外正常糖濃度（5.6 mmol/L）培養(yǎng)大鼠腎小球MCs，用Iipofectamine2000分別轉(zhuǎn)

14、染miRNA-27a mimics（miR-27a mimics組）、miRNA-27a inhibitors及陰性對照（NC mimics組和NC inhibitors組）。將未轉(zhuǎn)染MCs分為正常糖培養(yǎng)組（NG組）和單純高糖（25 mmol/L）培養(yǎng)組（HG組）。將轉(zhuǎn)染miRNA-27a inhibitors后的MCs培養(yǎng)于高糖（25 mmol/L）環(huán)境下（miR-27a inhibitors組）。處理72 h后，TaqMan探針實時

15、熒光定量PCR檢測系膜細胞miRNA-27a水平；實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測PPARγ mRNA水平；Western blotting法檢測PPARγ蛋白水平。細胞免疫熒光化學(xué)法檢測 PPARγ的表達及分布。構(gòu)建含有PPARγ-3′UTR靶標克隆野生型載體及 PPARγ-3′UTR靶標克隆突變型載體（mut-PPARγ-3′UTR），將這些載體與miRNA-27a過表達或miRNA-27a抑制載體共轉(zhuǎn)染 MCs

16、，轉(zhuǎn)染48 h后，通過雙熒光素酶報告實驗檢測 miRNA-27a對PPARγ-3′UTR熒光活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1．miR-27a mimics組 MCs中 miRNA-27a的水平明顯高于 NG組及 NC mimics組（P<0.05）；miR-27a inhibitors組MCs中miRNA-27a的水平明顯低于HG組及NC inhibitors組（P<0.05）；而NG組和NC mimics組比較，HG組和N

17、C inhibitors組比較，MCs中miRNA-27a的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）
　　2．與NG組比較，HG組PPARγ mRNA及蛋白水平明顯降低（P<0.05）；miR-27a mimics組 MCs中 PPARγ mRNA及蛋白水平明顯明顯低于 NG組（P<0.05）；miR-27a inhibitors組MCs中PPARγmRNA及蛋白水平明顯高于HG組（P<0.05）。NC mimics和NC inhib

18、itors對PPARγmRNA及蛋白水平無明顯影響（P>0.05）。
　　3．細胞免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示：PPARγ積聚于細胞核內(nèi)，miRNA-27a mimics可以明顯抑制PPARγ的表達（P<0.05），而miRNA-27a inhibitors則可以明顯抑制高糖誘導(dǎo)的PPARγ的表達下調(diào)（P<0.05）。
　　4．熒光素酶報告結(jié)果顯示：miRNA-27a mimics可以明顯抑制PPARγ-3′UTR熒光活性（P<0.

19、05），而miRNA-27a inhibitors則可以抑制miRNA-27a mimics引起的PPARγ-3′UTR熒光活性的降低（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　miRNA-27a可通過與PPARγ-3′UTR結(jié)合抑制PPARγ的表達。
　　第三部分 miRNA-27a通過調(diào)節(jié)PPARγ介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)堆積
　　目的:
　　探討 miRNA-27a對高糖誘導(dǎo)的系膜細胞增殖及細胞

20、外基質(zhì)堆積的影響及作用機制。
　　方法:
　　1．體外正常糖濃度（5.6 mmol/L）培養(yǎng)大鼠腎小球MCs，Iipofectamin2000瞬時轉(zhuǎn)染 miRNA-27a inhibitors、PPARγ siRNA載體或共轉(zhuǎn)染 miRNA-27a inhibitors及PPARγsiRNA。將單純轉(zhuǎn)染miRNA-27a inhibitors、共轉(zhuǎn)染miRNA-27a inhibitors和PPARγsiRNA后的MCs培養(yǎng)

21、于高糖（25 mmol/L）環(huán)境下。處理72 h后，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測各組膠原蛋白IV（Collagen IV, Col IV）、纖連蛋白（Fibronectin, FN）、TGF-β1、PAI-1的mRNA表達水平；Western blotting法檢測p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表達水平；CCK-8實驗檢測細胞增殖情況；流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化情況。
　　2．體內(nèi)實驗通過STZ誘導(dǎo)建立糖

22、尿病大鼠動物模型，運用反義寡核苷酸技術(shù)，設(shè)計合成化學(xué)修飾的antagomir-27a及miRNA-27a antagomir陰性對照（NC antagomir）。糖尿病大鼠隨機分為3組：糖尿病未治療組，antagomir-27a治療組及NC antagomir組。以正常大鼠作為正常對照組（Control組）。每兩周監(jiān)測血糖及24 h尿蛋白變化情況。8周末，處死動物，剝離腎臟，TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測系膜細胞miRNA-27

23、a水平；qRT-PCR檢測各組PPARγ、TGF-β1、PAI-1 mRNA水平；Western blotting法檢測PPARγ、p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表達；免疫組化檢測腎小球Col IV和FN表達水平；HE染色及透射電鏡觀察腎臟病理學(xué)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1．與正常糖培養(yǎng)的大鼠腎小球MCs相比，高糖明顯增加MCs中Col IV、FN、TGF-β1、PAI-1的 mRNA水平及p27Kip1、T

24、GF-β1、PAI-1蛋白水平（P<0.05）；而 miRNA-27a inhibitors可顯著抑制高糖對上述指標的影響（ P<0.05）；當(dāng)miRNA-27a inhibitors與PPARγsiRNA共轉(zhuǎn)染細胞時，miRNA-27a inhibitors的作用被PPARγsiRNA阻斷（P<0.05）。
　　2．與正常糖環(huán)境下培養(yǎng)的MCs相比，高糖環(huán)境下MCs明顯增殖（P<0.05）；細胞周期檢測顯示G0/G1期細胞比例升高

25、（P<0.05），S期細胞比例降低（P<0.05）。miRNA-27a inhibitors干擾后MCs增殖明顯被抑制，并抑制高糖誘導(dǎo)的G1期細胞周期阻滯（P<0.05）；PPARγ siRNA則可阻斷miRNA-27a inhibitors的上述效應(yīng)（P<0.05）。
　　3．與Control組比較，糖尿病未治療組血糖水平明顯升高（P<0.05），但不隨糖尿病病程的延長而逐漸增加；而antagomir-27a治療后對血糖水平無明

26、顯影響（P>0.05）。4、6、8周末，糖尿病未治療組24 h尿蛋白水平較Control組明顯升高（P<0.05），且隨時間的延長而逐漸增加；antagomir-27a治療后明顯降低24 h尿蛋白水平（P<0.05）。
　　4．a(chǎn)ntagomir-27a治療組腎皮質(zhì)中 miRNA-27a水平明顯低于糖尿病未治療組（P<0.05），而NC antagomir對miRNA-27a水平無明顯影響（P>0.05）。
　　5．a(chǎn)nta

27、gomir-27a治療組腎皮質(zhì)中PPARγ mRNA及蛋白水平明顯高于糖尿病未治療組（P<0.05），而 NC antagomir組與糖尿病未治療組比較，腎皮質(zhì)中PPARγ表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　6．與糖尿病未治療組相比，antagomir-27a治療組TGF-β1、PAI-1 mRNA水平明顯降低（P<0.05），p27Kip1、TGF-β1、PAI-1蛋白表達顯著降低（P<0.05）。而NC antag

28、omir組與糖尿病未治療組比較，腎皮質(zhì)中上述指標水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　7．免疫組化結(jié)果顯示antagomir-27a治療組Col IV和FN水平較糖尿病未治療組明顯降低（P<0.05）；而NC antagomir組與糖尿病未治療組比較兩者水平無顯著性差異(P>0.05)。
　　8．HE染色顯示antagomir-27a治療組大鼠腎小球系膜細胞增生及系膜基質(zhì)增多程度均較糖尿病未治療組明顯減輕。

29、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示糖尿病未治療組大鼠基底膜明顯增厚且不光滑，足細胞足突大面積融合、缺失，系膜細胞和基質(zhì)結(jié)節(jié)性顯著增生；antagomir-27a治療組大鼠足細胞足突融合明顯改善，系膜細胞和基質(zhì)增生明顯減輕。
　　結(jié)論:
　　1．miRNA-27a inhibitors明顯抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球MCs增殖及ECM蛋白過度堆積，其機制可能是通過調(diào)節(jié)其靶基因PPARγ水平來實現(xiàn)的。
　　2．a(chǎn)ntagomir-27a治療明顯