FoxO1過(guò)表達(dá)對(duì)糖尿病大鼠腎臟系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)堆積的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥，系膜細(xì)胞過(guò)度增殖在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1，2]。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（Forkhead transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）是FoxO亞家族中的一員，主要通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路聚集細(xì)胞內(nèi)外的多重下游信號(hào)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外應(yīng)激信號(hào)之間的平衡，在抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)糖脂代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等方面有

2、著重要的作用[3,4]。目前關(guān)于FoxO1調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖的研究主要集中于抗腫瘤方面，而其與糖尿病腎病中系膜細(xì)胞增殖的關(guān)系，研究較少。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)，F(xiàn)oxO1 mRNA水平降低，其蛋白磷酸化水平增高，病理顯示系膜細(xì)胞過(guò)度增生，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，表明FoxO1與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展有著重要關(guān)系。
　　p27Kip1是一種細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑，可以抑制多種細(xì)胞的增殖，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化，凋亡

3、方面有著舉足輕重的作用。研究表明，p27Kip1作為FoxO1重要的下游靶基因，其表達(dá)的降低與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5，6]。因此，在糖尿病大鼠體內(nèi)，F(xiàn)oxO1是否是通過(guò)調(diào)節(jié)p27Kip1的表達(dá)來(lái)抑制系膜細(xì)胞的增殖，從而減輕糖尿病腎臟病變，目前尚不清楚。本研究在動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)大鼠腎臟靶向性注射慢病毒，上調(diào)FoxO1的表達(dá)及活性，從而觀察其對(duì)腎臟系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞基質(zhì)堆積的影響并探討其可能機(jī)制。
　　材料與方法：
　　構(gòu)建空

4、慢病毒載體(LV-NC-GFP)及大鼠組成性激活突變型FoxO1慢病毒載體(LV-CA-FoxO1)。8周齡健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重（220±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫25℃，晝夜交替12小時(shí)，隨機(jī)選取100只構(gòu)建糖尿病大鼠模型，30只作為正常對(duì)照組。造模方法如下:禁食12小時(shí)后，按60mg/kg一次性腹腔注射1％STZ溶液，正常組注射相當(dāng)體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，72小時(shí)后連續(xù)3次測(cè)量血糖(Blood Glucose，B

5、G)，BG≥16.7mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)(4只失敗)，將成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為2周，4周，8周3個(gè)時(shí)期，各時(shí)期分為3組:糖尿病組（DM組），糖尿病FoxO1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染組（CA組）和糖尿病空病毒轉(zhuǎn)染組(NC組)。以糖尿病大鼠右側(cè)背部為手術(shù)入口，暴露大鼠右側(cè)腎臟，腎臟皮質(zhì)多部位注射組成性激活突變型FoxO1慢病毒載體或空病毒載體100μl，DM組注射同等體積的生理鹽水，然后逐層縫合。于病毒注射后2周、4周、8周末，代謝籠收集24小時(shí)尿，用

6、于測(cè)定24小時(shí)尿蛋白(UPro/24h)及尿白蛋白定量(UAIb)。稱量體重（Body Weight，BW）后用水合氯醛麻醉大鼠，眼眶取血，分離血清檢測(cè)血肌酐(serum creatinine，Scr)及尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)。剝離右腎，稱重并計(jì)算腎重指數(shù)(kidney weight/body weight ratio，KI)后取注射部位腎皮質(zhì)加OCT混合物（opti-mumcutting temper

7、ature compound）迅速于液氮中冷凍，制備冰凍切片，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)表達(dá)，以確定慢病毒是否轉(zhuǎn)染成功。取注射部位約1mm3大小腎皮質(zhì)置于4％預(yù)冷戊二醛固定用于電子顯微鏡檢查，取部分腎皮質(zhì)于4％多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫組化檢查。剩余腎皮質(zhì)迅速置于液氮中保存，熒光定量PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)中FoxO1、p27Kip1、纖溶酶原激活物抑制物(Plasmin

8、ogen activator inhibitor-1，PAI-1)、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、腎小球膠原Ⅳ(Collagen Ⅳ，Col Ⅳ)mRNA表達(dá)水平。Western bloting檢測(cè)腎皮質(zhì)中FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、p27Kip1、PAI-1蛋白表達(dá)。免疫組化檢測(cè)FN、ColⅣ表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.2周，4周，8周糖尿病大鼠腎皮質(zhì)冰凍切片于倒置熒光顯微鏡下均可以觀察

9、到大量GFP表達(dá)，說(shuō)明慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染大鼠腎皮質(zhì)并穩(wěn)定表達(dá)外源基因。
　　2.與NG組比較，DM組及NC組大鼠精神萎靡、飲水量及尿量多、墊料潮濕。CA組精神接近于正常組大鼠，而飲水量和尿量仍然較高，墊料較潮。與NG組相比，DM組各時(shí)間段體重（Bodyweight，BW）明顯降低，BG、腎重指數(shù)(kidneyweight/bodyweightratio，KI)升高(P＜0.05），其中2周時(shí)UPro/24h、UA1b、Ser、BU

10、N無(wú)顯著性差異(P＞0.05）。4周，8周時(shí)，上述指標(biāo)逐漸升高(P＜0.05)。CA組與DM組相比，2周時(shí)各指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而4周，8周時(shí)KI、UPro/24h、UA1b、Ser、BUN均明顯降低(P＜0.05)，BW、BG比較無(wú)顯著學(xué)差異(P＞0.05)。NC組與DM組比較各指標(biāo)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.HE染色顯示NG組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰;DM組與NC組大鼠腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，系膜基

11、質(zhì)增多，CA組上述病理改變明顯減輕。電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示NG組腎小球基底膜厚度均一，足突分布均勻，無(wú)微絨毛化，系膜細(xì)胞及基質(zhì)無(wú)增生;DM組與NC組大鼠隨時(shí)間進(jìn)展基底膜增厚或者不光滑，足突融合逐漸加重，系膜細(xì)胞及基質(zhì)結(jié)節(jié)性增生;CA組大鼠足突融合改善，系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度增生。
　　4.與NG組相比，DM組各時(shí)間段FoxO1、p27Kip1的mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），PAI-1、FN、ColⅣmRNA表達(dá)升高(P＜0.05)。

12、CA組較DM組FoxO1、p27Kip1mRNA水平明顯升高(P＜0.05）。PAI-1、FN、ColⅣmRNA表達(dá)則顯著降低(P＜0.05)。
　　5.各時(shí)間段，與NG組相比，DM組FoxO1表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而p-FoxO1及p-FoxO1/FoxO1比值明顯增加(P＜0.05)，CA組較DM組FoxO1表達(dá)明顯升高，p-FoxO1表達(dá)無(wú)差異(P＞0.05），p-FoxO1/FoxO1比值則顯著降低(P＜0.0

13、5)，上述結(jié)果表明腎臟轉(zhuǎn)染FoxO1慢病毒后其表達(dá)及活性顯著升高。與NG組相比，DM組p27Kip1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），PAI-1表達(dá)升高(P＜0.05)，CA組較DM組p27Kip1蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05），PAI-1表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，NC組與DM組之間各指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P＞0.05）。
　　6.免疫組化顯示，隨時(shí)間進(jìn)展，DM組FN及ColⅣ表達(dá)逐漸升高（P＜0.05）。CA組上述指標(biāo)表達(dá)明顯