重組exendin-4的克隆、表達(dá)與純化.pdf

1、exendin-4(腸降糖素類似物)是從一種蜥蜴(Gila monster lizard)的唾液腺毒素中分離出來的由39個氨基酸組成的多肽。它與胰升糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide 1，GLP-1)這種在2型糖尿病中調(diào)節(jié)血糖的關(guān)鍵物質(zhì)有53％的氨基酸同源性。exendin-4能夠通過激活GLP-1受體誘導(dǎo)胰島素釋放。由于exendin-4不被二肽基肽酶(DDP-Ⅳ)降解，其半衰期比GLP-1長，降血糖作用也更強(qiáng)、更

2、穩(wěn)定。因此，exendin-4是一種有前景的2型糖尿病治療藥物。目前，人工合成多肽成本較高，因此，用DNA重組技術(shù)建立一套在大腸桿菌中高效表達(dá)及純化重組exendin-4的方案是本研究努力的方向。在本研究中，我們?nèi)斯ず铣闪薔端帶有牛腸激酶位點、C端帶有終止密碼子的exendin-4基因，并將基因重組到pET-32a(+)載體中，構(gòu)建成exendin-4與硫氧還蛋白(thioredox)及六聚組氨酸(hexahistidine)的融合表達(dá)

3、載體pET-32a(+)-exendin-4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL12(DE3)獲得表達(dá)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵的菌體超聲破碎后，裂解液用Ni離子親和層析純化得到融合蛋白。最后經(jīng)用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的牛腸激酶輕鏈(bovine-EKL)切割以制備重組exendin-4。 結(jié)果表明，在30℃用0.1mM濃度的IPTG對篩選到的exendin-4/His融合蛋白工程菌進(jìn)行8小時誘導(dǎo)表達(dá)的效果最佳，得

4、到的目的蛋白約占總蛋白量的16％以上。經(jīng)檢測，最終每升菌液可獲得約32mg純度為88％以上的exendin-4/His融合蛋白。用G418 YPD平板篩選獲得了多bovine-EKL基因拷貝的酵母工程菌，在30℃保持以0.5％的甲醇對其進(jìn)行96小時誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了含較高純度分泌型bovine-EKL蛋白的酵母上清。后經(jīng)硫酸銨沉淀和陰離子交換層析，獲得純度近100％的bovine-EKL蛋白。最后經(jīng)過超濾濃縮得到20mg/L(1.6uμ/

5、μl)的終產(chǎn)品。酶切驗證實驗表明，約1067ng bovine-EKL終產(chǎn)品可切開50μg融合蛋白。隨后，應(yīng)用自制bovine-EKL切割exendin-4/His融合蛋白獲得分子量約為4.2kDa的酶解片斷，這與exendin-14理論分子量一致。本研究結(jié)果表明，運(yùn)用pET-32a(+)載體能使exendin-4重組蛋白高效表達(dá)；運(yùn)用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的牛腸激酶輕鏈具有活性，并能用于切割exendin-4/His融合蛋白從而制備重組ex