重組葡激酶的高效表達(dá)與分離純化.pdf

1、血栓病是人類面臨的一類主要疾病，包括急性心肌梗塞、腦血栓、肺靜脈血栓、動(dòng)脈血栓和缺血性休克等。其中急性心肌梗塞(AMI)的死亡率高達(dá)30％。溶纖治療被認(rèn)為是治療血栓病最為有效的方法，尋找、研制效果好、副作用小的治療藥物一直是世界范圍的熱門課題。重組葡激酶(Recombinant staphylokinase,rSak)具有纖維蛋白特異性高、纖維蛋白原降解少、對血小板富集型血栓作用強(qiáng)以及價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，使其成為一種極具潛力的特異性溶栓劑。

2、 本研究rSak是以活性可溶性狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，在前期研究的基礎(chǔ)上，對E.coli生產(chǎn)rSak的發(fā)酵工藝及其下游純化工藝進(jìn)行了全面優(yōu)化，建立了一套高效表達(dá)、分離純化簡便、回收率高的工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可行性研究。 其主要內(nèi)容包括： Ⅰ．基因工程菌生產(chǎn)rSak的發(fā)酵工藝優(yōu)化。 Ⅱ．發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)鑒定。 Ⅲ．rSak原液活性分析。 本研究的主要研究結(jié)果如下： Ⅰ、通過

3、單因素?fù)u瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究了碳源、氮源、培養(yǎng)溫度對菌體生長和rSak表達(dá)的影響，確定合適的搖瓶培養(yǎng)條件：葡萄糖為碳源，氮源為酵母粉和蛋白胨(1：2)，培養(yǎng)溫度為30～32℃； Ⅱ、將搖瓶優(yōu)化出的培養(yǎng)條件放大至發(fā)酵罐進(jìn)行單批發(fā)酵，研究了誘導(dǎo)維持時(shí)間對菌體的生長和rSak表達(dá)的影響，確定最佳誘導(dǎo)維持時(shí)間應(yīng)控制在3～4h，此時(shí)rSak表達(dá)水平為35％左右，蛋白表達(dá)量和菌體密度相對較高且雜蛋白較少； Ⅲ、采用正交法對大罐發(fā)酵培養(yǎng)條

4、件進(jìn)一步優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)四個(gè)因素對菌體密度和目的蛋白質(zhì)的表達(dá)存在這不同程度的影響，其影響大小依次為：葡萄糖濃度>飽和氧濃度>氮源濃度>pH，并進(jìn)一步確定了最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件：葡萄糖濃度2％、氮源濃度1.5％、pH6.8和飽和氧濃度30％。采用此優(yōu)化條件對基因工程菌進(jìn)行連續(xù)三批發(fā)酵，蛋白質(zhì)表達(dá)量和菌體密度都較高，平均菌體密度A<,600>為35.8，平均DCW為8.2g/L以及平均蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到52％。 Ⅳ、利用超濾系統(tǒng)進(jìn)行粗純化

5、，大大縮短了生產(chǎn)周期，對制品起到提純、濃縮和轉(zhuǎn)換介質(zhì)的作用；確立了最佳的純化工藝：粗提制品經(jīng)DEAE-SepharoseFF和SP-Sepharose FF兩步柱層析獲得重組葡激酶原液；將兩種同一性質(zhì)不同強(qiáng)度的陽離子交換柱進(jìn)行對比，研究證明SP-Sepharose FF層析柱更適合于重組葡激酶的分離純化；對SP-Sepharose FF柱層析洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)表明低鹽濃度逐步梯度洗脫更易于去除雜蛋白、提純目的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)回收率達(dá)到

6、32％，SDS-PAGE純度高達(dá)99％；在柱層析時(shí)，上樣速度和洗脫速度對蛋白回收率的影響較大，通過實(shí)驗(yàn)證明，DEAE-Sepharose FF層析時(shí)，上樣速度以較快為宜，而SP-Sepharose FF層析時(shí)適合較慢的上樣速度；在對SP-Sepharose FF層析柱洗脫時(shí)，洗脫速度宜較快。 Ⅴ、經(jīng)小試工藝放大，進(jìn)行連續(xù)三批試生產(chǎn)并對rSak原液作進(jìn)一步的檢測。rSak經(jīng)SDS-PAGE檢測為單帶，且與rSak標(biāo)準(zhǔn)品位置相同，通

7、過SDS-PAGE和HPLC分析，其純度均在99％以上，分子量為15.5kD，與文獻(xiàn)報(bào)道的相符，分子內(nèi)沒有二硫鍵，分子為單鏈聚合多肽。三批原液紫外吸收光譜、抗生素殘留和細(xì)菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果均符合基因工程制品的規(guī)定要求。 Ⅵ、采用人纖維蛋白溶解法測定rSak原液生物學(xué)活性，本方法靈敏較高，連續(xù)三批產(chǎn)品活性分別是2.2×10<'8>、3.1×10<'8>、2.8×10<'8>IU/ml，活性均較高并且穩(wěn)定，進(jìn)一步證明了發(fā)酵和純化工藝重