環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶的基因分析、誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化的研究.pdf

1、環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是一種重要的工業(yè)用酶，用來(lái)生產(chǎn)環(huán)糊精和寡糖，該酶基因已經(jīng)可以從30多種細(xì)菌中分離，其中幾種已經(jīng)得到鑒定，生化性質(zhì)也得以驗(yàn)證。為更好地研究環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶的作用機(jī)制和功能，在基因水平和蛋白水平上針對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)和不同CGTase亞種的相似性也進(jìn)行了分析研究。 本文對(duì)來(lái)源于嗜堿性芽孢桿菌N-227菌株染色體上一段編碼β-環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行克隆分析、誘導(dǎo)表達(dá)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，發(fā)酵得到CGTase的

2、較高酶活力，分離純化得到純的蛋白酶。 對(duì)包含有自己的啟動(dòng)子且能夠直接在大腸桿菌中表達(dá)β-CGTase的DNA序列進(jìn)行測(cè)序分析，該片斷DNA包含有4114個(gè)堿基，從745位點(diǎn)到2883位點(diǎn)包含2139個(gè)堿基，為一個(gè)推定的編碼713個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)閱讀框，和來(lái)源于Bacillus circulansA11的β-環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶氨基酸完全一致；具有環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶典型的五個(gè)結(jié)構(gòu)域A—E,在A—B結(jié)構(gòu)域中包含有七個(gè)屬于α-淀粉酶家族的保

3、守區(qū)域(Ⅰ—Ⅶ)。對(duì)該酶基因進(jìn)行PCR并克隆到表達(dá)載體pET28b上，利用乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得了高效表達(dá)，這對(duì)于β-環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用和降低成本具有重要的價(jià)值。 為提高酶活力，研究了不同添加物質(zhì)及其濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。 表達(dá)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的工程菌E.coli BL21(DE3)在含有不同濃度葡萄糖的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，0.2％的葡萄糖濃度使酶活提高2.7倍，經(jīng)0.75％的乳糖誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)量與1 mmol

4、/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)相當(dāng)。選擇卡那霉素(Kan)、乳糖、Triton-X、甘氨酸的終濃度這四個(gè)因素，分別考察三個(gè)水平，由L<,9>正交試驗(yàn)確定影響產(chǎn)酶活性的各因素的最佳濃度，即Kan 10μg/mL、乳糖0.75％、Triton-X 0.5％、甘氨酸1.0％，以此條件發(fā)酵E.coli BL21(DE3)CGTase菌種，發(fā)酵上清液中測(cè)得的酶活值為247.4 U/mL，達(dá)到初始值的5.2倍左右。 β-環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液經(jīng)過(guò)淀

5、粉-酒精沉淀或淀粉-硫酸銨沉淀初步純化，然后經(jīng)Sephacryl S-100凝膠層析后，比活力分別提高了16倍、21倍、50倍，由初始11.44 U/mg蛋白質(zhì)增加到572.67 U/mg蛋白質(zhì)，回收率分別為72.4％、66.4％、40.9％，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一的蛋白帶，酶的分子量為70 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶的最適pH和最適溫度分別為6.0和60℃，在pH 6.0～1 0.0范圍內(nèi)，55℃以下保溫30 min基本保