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文檔簡介
1、研究目的:
利用白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子缺失菌庫,篩選不同缺失菌對抗真菌藥物敏感性差異,發(fā)現(xiàn)對藥物敏感性產(chǎn)生顯著影響的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而考察該轉(zhuǎn)錄因子對白念珠菌藥物敏感性的影響作用及調(diào)控機(jī)制。
研究方法:
通過微量液基稀釋法、點板實驗(Spot Assay)進(jìn)行白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子缺失菌的藥物敏感性的篩選。采用實時定量PCR(Realtime-PCR)的方法檢測白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子缺失菌中與耐藥性相關(guān)的外排泵等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水
2、平,并通過羅丹明6G外排實驗,進(jìn)一步考察白念珠菌外排泵活性。通過測定胞內(nèi)ATP水平和線粒體膜電位,考察藥物外排泵活性改變是否與線粒體呼吸功能及能量代謝異常有關(guān)。利用鐵離子螯合劑紅菲繞啉(BPS)考察缺失菌株鐵代謝情況。通過生長曲線法考察菌株對活性氧類物質(zhì)H2O2的敏感性,并測定胞內(nèi)活性氧水平。Realtime-PCR實驗考察抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)并檢測菌株胞內(nèi)還原酶活性。
研究結(jié)果:
通過藥物敏感性篩選發(fā)現(xiàn),與親本菌S
3、N250相比,pho4△/△和hap2△/△對唑類藥物的敏感性顯著增加。pho4△/△對唑類抗真菌藥敏感,對羅丹明外排能力減弱,但耐藥相關(guān)基因CDR1,MDR1以及ERG11的表達(dá)卻有所增加。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn),pho4△/△對H2O2的敏感性顯著增加,菌株抵抗氧化應(yīng)激的能力下降,胞內(nèi)活性氧水平下降??疾焱蛔冎甑木€粒體功能,發(fā)現(xiàn)ATP含量下降,線粒體膜電位略升高。
HAP2基因缺失導(dǎo)致白念珠菌對抗真菌藥物的敏感性增高,藥物外排泵編
4、碼基因CDR1,MDR1以及耐藥相關(guān)基因ERG11轉(zhuǎn)錄水平下降,突變株對羅丹明6G外排能力降低,即藥物外排泵活性下降。HAP2基因缺失導(dǎo)致菌株在缺鐵環(huán)境中生長減慢,胞內(nèi)鐵離子含量降低。缺失了HAP2基因的菌株,線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ主要成分琥珀酸脫氫酶編碼基因SDH2表達(dá)下降,胞內(nèi)ATP水平和線粒體膜電位均降低,菌株能量代謝異常,胞內(nèi)ROS濃度與野生型沒有差異,但與鐵離子匱乏相一致的是,在咪康唑誘導(dǎo)下,其ROS產(chǎn)生的能力顯著低于野生型,同
5、時,抗氧化基因SOD4,GLR1,TRR1以及胞內(nèi)GSH含量顯著增高。
研究結(jié)論:
轉(zhuǎn)錄因子Pho4的缺失可能通過降低白念珠菌的抗氧化應(yīng)激能力,減弱對藥物的外排作用而導(dǎo)致對唑類藥物敏感,但其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
HAP2基因是鐵代謝相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子,該基因缺失導(dǎo)致白念珠菌鐵離子攝取降低,鐵代謝異常。由于鐵離子是眾多酶促反應(yīng)的輔助離子,在缺失HAP2基因的白念珠菌中,菌株能量代謝異常,ATP產(chǎn)生減
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