羽苔素E抗真菌活性試驗(yàn)及其逆轉(zhuǎn)氟康唑耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、近年來，真菌感染的發(fā)病率逐年上升。這主要是由于一些醫(yī)療措施的改變，包括廣譜抗生素的濫用、HIV感染、以及癌癥化療和器官移植所引起的免疫抑制等等。特別是持續(xù)性免疫缺陷患者，其真菌感染率很高。真菌感染難以治療，一方面是現(xiàn)有抗真菌藥物品種有限，活性不強(qiáng)且具有毒副作用，另一方面是由于抗真菌藥物在臨床上大量應(yīng)用，導(dǎo)致真菌耐藥性的迅速發(fā)展，嚴(yán)重影響了藥物的治療效果。真菌感染率的不斷增加、致病菌譜的不斷增寬以及耐藥真菌所致感染的臨床嚴(yán)重性，促進(jìn)了真菌

2、耐藥機(jī)制的研究和抗真菌活性化合物的篩選。 羽苔素E是由我院天然藥化實(shí)驗(yàn)室從苔蘚類植物地錢中提取的雙聯(lián)芐類化合物，初步活性篩選實(shí)驗(yàn)表明具有較好的抗真菌活性。本實(shí)驗(yàn)首先對羽苔素E(Plagiochin E)的抗真菌活性進(jìn)行了評價(jià)，并測定了羽苔素E與氟康唑的聯(lián)合抗真菌作用。在此基礎(chǔ)上，觀察了羽苔素E與氟康唑合用對白念珠菌耐藥株的作用。并進(jìn)一步對羽苔素E逆轉(zhuǎn)真菌對氟康唑耐藥的機(jī)制進(jìn)行了研究。一、羽苔素E抗真菌作用及與氟康唑的聯(lián)合抗真菌作

3、用的研究 羽苔素E體外抗真菌活性的測定是按美國臨床標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)建立的真菌敏感性測定方案(M27-A)進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)所用菌株為15株臨床新近分離的白色念珠菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羽苔素E具有中等抗真菌活性，MIC為16μg/ml。在與氟康唑聯(lián)合抗菌活性實(shí)驗(yàn)中，氟康唑濃度設(shè)為0.03125～4μg/ml，羽苔素E濃度設(shè)為0.5～2561μg/ml。聯(lián)合抗菌活性以抑菌濃度分?jǐn)?shù)(fractional inhibitedconcen

4、tration，F(xiàn)IC)指數(shù)評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羽苔素E與氟康唑合用時(shí)能明顯降低氟康唑和羽苔素E的用藥量，顯示出相加的抗真菌作用。二、羽苔素E單用或與氟康唑合用對耐藥株的抗真菌作用的研究 本實(shí)驗(yàn)中共用白念耐藥株四株，其中兩株為臨床分離獲得(QL-14，QL-28)，其MIC值均為128ug/ml，另外兩株由氟康唑體外誘導(dǎo)獲得。 1．白念耐藥株的體外誘導(dǎo)：取兩株白念敏感株(SDEY-24,SDEY-09)，在含氟康 唑

5、16ug/ml的YEPD液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，測定誘導(dǎo)后氟康唑?qū)Ω鞔甑?MIC值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩株菌株經(jīng)不同時(shí)間均誘導(dǎo)出耐藥性，但體外傳代所需的 時(shí)間不同，菌株SDEY-24和SDEY-09分別于第7代(35d)和第8代(38d)MIC 達(dá)64ug/ml，證實(shí)已誘導(dǎo)出耐藥性。 2．對耐藥株的抗真菌作用：同樣采用微量稀釋法觀察了羽苔素E單獨(dú)應(yīng)用及與 氟康唑合用對耐藥株的抗真菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對氟康唑耐藥株，羽苔素E

6、 單獨(dú)應(yīng)用仍能表現(xiàn)出與敏感株相似的抗真菌作用(MIC為16～32ug/m1)。而與 氟康唑合用，觀察到羽苔素E能明顯降低氟康唑?qū)δ退幹甑挠昧?，且羽苔素E 的MIC值也顯著降低，F(xiàn)IC<0.5，二者合用對耐藥株表現(xiàn)出協(xié)同的抗真菌作用。 三、羽苔素E逆轉(zhuǎn)真菌對氟康唑耐藥的機(jī)制研究 1．羽苔素E與氟康唑合用對真菌細(xì)胞內(nèi)氟康唑聚集的影響試驗(yàn)：所用菌株為白 念氟康唑耐藥株．(MIC=128ug/m1)，最終菌懸液濃度是0.6

7、x10<'7>cfu/ml。羽苔素E 的濃度水平設(shè)為0.5MIC，2MIC及8MIC，氟康唑濃度設(shè)為0.25ug/ml。菌懸液與 氟康唑單獨(dú)培養(yǎng)及氟康唑和羽苔素E聯(lián)合培養(yǎng)24小時(shí)后，離心得到真菌細(xì)胞，然后經(jīng)皂化、提取等過程得到菌體細(xì)胞內(nèi)聚集的氟康唑。氟康唑的測定采用高效 液相與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，并選用酮康唑作為內(nèi)標(biāo)物。氟康唑定量是通過測定質(zhì)荷 比為307的分子離子及質(zhì)荷比為220的碎片離子信號進(jìn)行的，最低檢測限為 1.0ng/m

8、l，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1.0-100ng/ml，相關(guān)系數(shù)為0.9956。通過精密度、回收率的檢測，證實(shí)此方法精密、準(zhǔn)確，可以用于白念珠菌細(xì)胞內(nèi)的氟康唑濃度 測定。濃度檢測結(jié)果顯示，當(dāng)與氟康唑合用時(shí)，羽苔素E能顯著增加耐藥株菌 體細(xì)胞內(nèi)氟康唑的聚集，且細(xì)胞內(nèi)氟康唑的量隨著合用羽苔素E濃度的增加而 增加。這可能是羽苔素E與氟康唑合用對耐藥株呈現(xiàn)協(xié)同的抗真菌作用的機(jī)制 之一。 2．羽苔素E對若丹明123在耐藥株中蓄積與分布的影

9、響：若丹明123是一種熒 光物質(zhì)，可通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且是細(xì)胞膜上主動(dòng)外排系統(tǒng)的底物，可通過檢測菌株對若丹明123的泵出，來反映菌株細(xì)胞膜上多藥耐藥蛋白功能的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)所用菌株為氟康唑耐藥株(MIC=128μg/m1)和敏感株(MIC=0.5μg/m1)，并觀察羽苔素E對耐藥株中若丹明123泵出的影響，羽苔素E的濃度水平設(shè)為0.5MIC，2MIC及8MIC。菌株在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度達(dá)到10<'7>

10、cfu/ml時(shí)，離心收集細(xì)胞，總菌量約為10<'9>cfu。用PBS緩沖液進(jìn)行沖懸，加入若丹明123(終濃度為10μM)，并加入不同濃度的羽苔素E溶液，35℃振蕩培養(yǎng)，每隔10min取標(biāo)本1ml，離心收集上清液，上清液用熒光分光光度計(jì)測定吸光度。后離心剩余菌懸液，菌體用含5％葡萄糖PBS緩沖液沖懸，35℃振蕩培養(yǎng)，同樣方法取上清液測定吸光度。上清液中若丹明123的濃度通過預(yù)先建立的若丹明123的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。結(jié)果顯示，所有菌株在無能量

11、供應(yīng)時(shí)，若丹明123可快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，耐藥株和敏感株對若丹明123的吸收無明顯差異；加入葡萄糖提供能量后，耐藥株外排若丹明123與敏感株相比顯著增加。而羽苔素E對若丹明123的吸收無顯著影響，卻可顯著抑制若丹明123的泵出。應(yīng)用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的觀察，結(jié)果與熒光分光光度計(jì)法檢測一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示羽苔素E逆轉(zhuǎn)氟康唑耐藥的機(jī)制可能是通過抑制了主動(dòng)外排系統(tǒng)的功能。 3．羽苔素E對白念耐藥株細(xì)胞膜上主動(dòng)外排基因CD

12、Rl表達(dá)水平(mRNA)的影響：在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR法檢測羽苔素E對白念耐藥株細(xì)胞膜上主動(dòng)外排基因CDR1表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)所用菌株為臨床分離的氟康唑耐藥株(MIC=128μg/ml)、敏感株(MIC=0.5μg/ml)、氟康唑體外誘導(dǎo)獲得耐藥株(MIC=64μg/ml)、臨床分離的耐藥株羽苔素E用藥組(MIC=128μg/ml，羽苔素E濃度128μg/ml)。常規(guī)方法抽提菌株總RNA，根據(jù)主動(dòng)外排泵基因設(shè)計(jì)特異性PC

13、R引物，擴(kuò)增主動(dòng)外排基因CDRl，以actl基因?yàn)閮?nèi)參照，RT-PCR檢測各組菌株中主動(dòng)外排基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，所有菌株均有基因CDRl的表達(dá)，耐藥株基因表達(dá)量顯著高于敏感株，氟康唑體外誘導(dǎo)獲得的耐藥株其CDRl的表達(dá)也明顯增加。羽苔素E128μg/ml能夠明顯抑制耐藥株中CDR1的表達(dá)水平。結(jié)果提示，主動(dòng)外排基因的表達(dá)增多是白念珠菌對氟康唑耐藥的重要機(jī)制之一。羽苔素E能夠明顯抑制耐藥菌株主動(dòng)外排基因mRNA水平的表達(dá)，進(jìn)一步證

14、實(shí)了羽苔素E逆轉(zhuǎn)氟康唑耐藥的主要機(jī)制是通過抑制了耐藥株細(xì)胞膜上主動(dòng)外排系統(tǒng)的表達(dá)。 總之，本論文主要評價(jià)了天然雙聯(lián)芐類化合物一羽苔素E在體外抗白色念珠菌的活性以及與氟康唑的聯(lián)合抗真菌作用。并在體外用氟康唑誘導(dǎo)獲得白念耐藥株，觀察了羽苔素E本身及與氟康唑合用對耐藥株的作用，并對羽苔素E逆轉(zhuǎn)氟康唑耐藥的機(jī)制進(jìn)行研究。采用液一質(zhì)聯(lián)用法測定了白念耐藥株細(xì)胞內(nèi)氟康唑的濃度；建立并采用熒光法和共聚焦激光掃描顯微鏡等方法，研究了羽苔素E對耐