雙聯(lián)芐類(lèi)化合物羽苔素E的抗真菌機(jī)制.pdf

1、近年來(lái),隨著廣譜抗生素的大量應(yīng)用、艾滋的蔓延、癌癥化療和器官移植所引起的免疫抑制的增加、以及器官插管術(shù)的廣泛開(kāi)展,臨床真菌感染的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。特別是持續(xù)性免疫缺陷患者,其真菌感染率更高。真菌感染,特別是深部真菌感染難以治療。臨床常用抗真菌藥物主要是唑類(lèi)藥物和兩性霉素B,這些抗真菌藥物均對(duì)人體有不同程度的毒副作用；且隨著抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用,臨床上出現(xiàn)越來(lái)越嚴(yán)重的真菌耐藥現(xiàn)象。因此,臨床上迫切需要尋找新的抗真菌藥物來(lái)治療真

2、菌感染。
　　 苔蘚植物是植物界中僅次于被子植物的高等植物,全世界約有23000種。其中蘚(mosses)14000余種,苔(liverworts)6000余種,角苔(hornworts)300余種。其在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上位于藻類(lèi)和蕨類(lèi)植物之間。在中國(guó)和印度,苔蘚植物作為一種傳統(tǒng)藥物,被用來(lái)治療心血管疾病、扁桃體炎、支氣管炎、中耳炎、膀胱炎、皮膚病以及燒傷等。近年來(lái)植物學(xué)家從苔蘚植物中分離獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的萜類(lèi)化合物和芳香

3、族化合物,其中許多可作為新藥研究的優(yōu)良先導(dǎo)化合物。對(duì)苔類(lèi)植物活性成分的研究表明苔類(lèi)植物是生物活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。
　　 地錢(qián)屬植物為葉狀體苔類(lèi)。從地錢(qián)中分離得到的大環(huán)雙聯(lián)芐具有廣泛的生物學(xué)活性,如抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗細(xì)菌和細(xì)胞毒活性等,因此它們受到越來(lái)越多的關(guān)注。羽苔素E是從地錢(qián)(Marchantia polymorpha L.(Marchantiaceae))中分離得到的一種雙聯(lián)芐類(lèi)化合物。藥理學(xué)活性實(shí)驗(yàn)表明2～12

4、μg/ml羽苔素E可以逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的K562/AO2細(xì)胞的多藥耐藥性,而對(duì)正常細(xì)胞僅表現(xiàn)微弱毒性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),羽苔素E有抗白色念珠菌的作用,并通過(guò)提高耐藥真菌細(xì)胞內(nèi)氟康唑藥物濃度而逆轉(zhuǎn)真菌耐藥。提示羽苔素E具有非常好的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。但是羽苔素E的抗真菌作用機(jī)制尚未闡明。因此,本課題的目的就是通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)闡明羽苔素E的抗真菌機(jī)制。
　　 基因表達(dá)譜分析技術(shù)為羽苔素E的抗真菌機(jī)制研究提供了全新和有效的研究手段。利用白色念珠菌

5、基因組芯片繪制了羽苔素E作用后白色念珠菌的基因表達(dá)譜,分析比較相互間的不同,在全基因范圍內(nèi)尋找受羽苔素E影響的相關(guān)基因?；蛐酒Y(jié)果顯示多個(gè)被羽苔素E上調(diào)或下調(diào)的基因與線(xiàn)粒體功能有關(guān)。而線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器,在氧代謝、ATP產(chǎn)生和鈣平衡中發(fā)揮重要作用。提示線(xiàn)粒體是羽苔素E的潛在抗真菌靶點(diǎn)。因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了羽苔素E對(duì)白色念珠菌線(xiàn)粒體功能的影響。在實(shí)驗(yàn)中,采用羅丹明染色法測(cè)定羽苔素E作用后白色念珠菌的線(xiàn)粒體膜電勢(shì),高效液相色譜法

6、測(cè)定白色念珠菌線(xiàn)粒體內(nèi)ATP含量,分光光度法測(cè)定線(xiàn)粒體F0F1-ATPase和脫氫酶活性,熒光法測(cè)定線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羽苔素E導(dǎo)致白色念珠菌線(xiàn)粒體膜電勢(shì)超極化和線(xiàn)粒體內(nèi)ATP耗竭。線(xiàn)粒體F0F1-ATPase水解ATP的活性被顯著提高,使得線(xiàn)粒體內(nèi)ATP被過(guò)度水解,導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)ATP耗竭。在水解ATP的同時(shí),F0F1-ATPase將質(zhì)子由線(xiàn)粒體胞漿泵入線(xiàn)粒體膜間隙,進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電勢(shì)超極化。線(xiàn)粒體脫氫酶的活性被顯著抑制,

7、引起真菌細(xì)胞內(nèi)能量代謝異常,導(dǎo)致ATP合成減少。羽苔素E所致線(xiàn)粒體功能的異常導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧累積。抗氧化劑半胱氨酸不但可以抑制羽苔素E誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧累積,而且可以抑制羽苔素E的抗真菌活性。提示活性氧是羽苔素E發(fā)揮抗真菌作用的關(guān)鍵介質(zhì)。
　　 活性氧是真菌凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究羽苔素E誘導(dǎo)的白色念珠菌線(xiàn)粒體活性氧累積是否導(dǎo)致真菌凋亡。實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)羽苔素E作用后細(xì)胞周期的變化,超薄透射電鏡觀(guān)察真菌

8、超微結(jié)構(gòu)的改變,DAPI染色法觀(guān)察細(xì)胞核形態(tài)變化,FITC-annexin V染色法觀(guān)察白色念珠菌磷脂酰絲氨酸的外翻,RT-PCR法測(cè)定羽苔素E對(duì)白色念珠菌CDC28、CLB2和CLB4表達(dá)水平的影響,FITC-VAD-FMK熒光染色法測(cè)定羽苔素E作用后白色念珠菌metacaspase活性,分光光度法測(cè)定線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羽苔素E導(dǎo)致白色念珠菌出現(xiàn)典型的凋亡特征,包括細(xì)胞周期阻滯在G2/M期、染色體凝集、細(xì)胞核裂解和磷

9、脂酰絲氨酸的外翻。提示羽苔素E導(dǎo)致了白色念珠菌細(xì)胞凋亡。CDC28、CLB2和CLB4的表達(dá)被羽苔素E下調(diào),導(dǎo)致白色念珠菌細(xì)胞周期阻滯。羽苔素E促進(jìn)白色念珠菌線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放,并激活了metacaspase?？寡趸瘎┌腚装彼嵋种朴鹛λ谽導(dǎo)致的細(xì)胞核裂解、磷脂酰絲氨酸的外翻以及metacaspase的活化,提示活性氧是羽苔素E所致細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羽苔素E通過(guò)引起白色念珠菌線(xiàn)粒體活性氧累積,進(jìn)而激活metacaspas

10、e誘導(dǎo)真菌凋亡,從而發(fā)揮其抗真菌作用。
　　 細(xì)胞壁是真菌細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu),完整的細(xì)胞壁為剛性結(jié)構(gòu),作為物理化學(xué)屏障保護(hù)細(xì)胞及其內(nèi)的酶類(lèi),并控制細(xì)胞內(nèi)膨脹壓力以維持菌體的完整性。細(xì)胞壁還參與調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌,在維持真菌的生長(zhǎng)和正常的生理功能中起到重要作用。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分之一。幾丁質(zhì)合成酶催化N-乙酰氨基葡萄糖在細(xì)胞膜上聚合成幾丁質(zhì),在真菌細(xì)胞的分裂和成熟中發(fā)揮重要作用。在前期實(shí)驗(yàn)中,透射電鏡結(jié)果顯示

11、羽苔素E處理后的白色念珠菌細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯損傷,并且細(xì)胞分裂受阻。提示羽苔素E可能對(duì)細(xì)胞壁幾丁質(zhì)合成有抑制作用。采用熒光法測(cè)定羽苔素E對(duì)幾丁質(zhì)合成酶活性以及幾丁質(zhì)原位合成的影響,并用熒光定量PCR法測(cè)定羽苔素E對(duì)三種幾丁質(zhì)合成酶基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羽苔素E抑制了幾丁質(zhì)合成酶活性和幾丁質(zhì)的原位表達(dá)。細(xì)胞壁合成被抑制導(dǎo)致細(xì)胞壁損傷,使得真菌細(xì)胞對(duì)滲透壓敏感,導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡,從而發(fā)揮羽苔素E的抗真菌作用。此外,真菌細(xì)胞壁的損傷有益于氟