玉米C4途徑關鍵酶基因(PPDK、NADP-ME)的克隆及PPDK、PEPC在擬南芥中的表達分析.pdf

1、光合作用是植物生物學產量的源泉，通過基因工程手段人為加強“C4特性”在C3遺傳背景下的發(fā)揮，實現C3植物光合途徑的C4化，對于提高作物光能利用率和產量具有重要意義。本試驗從酶活和光合均高的玉米自交系中克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)和依賴于NADP的蘋果酸酶(NADP-ME)基因，并利用PPDK和本實驗室先前克隆的PEPC基因(GeneBank：FJ415327)轉化擬南芥，研究了這兩個基因的單獨及協同作用，通過其生理生化方

2、面的變化，為C3作物光合效率的改善提供了候選基因，為C4途徑關鍵酶導入小麥等C3作物提供了依據。
　　 主要結論如下：
　　 1.利用同源克隆技術，從玉米中克隆了PPDKI(GenBank：GU363532)和NADP-ME基因的cDNA，并插入雙元表達載體pCAMBIA3301、pCAMBIA1391中，構建了p3301-PPDK、p3301-ME和p1391-ME融合表達載體。序列測定結果表明，PPDK基因長度為30

3、04Bp，包含一個起始密碼子和971個氨基酸的開放閱讀框，與已登陸的玉米PPDK基因(GeneBank：BT054438)相比，氨基酸序列同源性可達99.4％；NADP-ME基因長度為2127Bp，包含一個起始密碼子和636個氨基酸的開放閱讀框，與已登陸的玉米NADP-ME基因(GenBank：NM＿001111843.1)相比，氨基酸序列同源性可達99.6％。
　　 2.Southernblot表明玉米PPDK、PEPC基因已

4、整合到擬南芥基因組中，擬南芥轉化率為0.69％，雙基因共轉化率為0.07％，66.7％的雙基因擬南芥符合Mendel單基因的遺傳規(guī)律。利用農桿菌介導法將p3301-PPDK和本實驗室曾構建的p3301-PEPC高效表達載體導入擬南芥中，篩選到327株抗性轉基因擬南芥，其中PEPC株系125株，PPDK株系175株，PPDK、PEPC共表達株系12株，轉p3301株系15株，篩選到PPDK、PEPC、PPDK+PEPC、p3301純系各2

5、4、26、8、3個。
　　 3.RT-PCR、熒光定量PCR、Westernblot分析表明外源基因在擬南芥基因組中得到正確表達，且轉PPDK、PEPC基因植株的表達量存在較大差異。熒光定量PCR分析現蕾期PPDK、PEPC基因的相對表達量分別在1.0-4.2倍和1.0-13.3倍；用QuantityOne軟件對Westernblot進行定量分析表明，PPDK、PEPC基因的蛋白相對表達量分別在1.9-2.5倍和1.6-3.7倍

6、。
　　 4.轉單、雙C4關鍵酶基因均可以提高擬南芥光合速率，雙基因的平均光合速率高于轉PEPC基因的平均光合速率，轉PEPC基因的平均光合速率高于轉PPDK基因的平均光合速率。T3代轉基因擬南芥酶活和光合速率測定表明：T3代轉基因擬南芥PPDK、PEPC酶活分別比對照增加0.61-3.63倍和0.77-4.81倍，平均增加1.89和1.48倍；轉PPDK基因擬南芥光合速率增加3.3-25.3％，平均增加12.2％，轉PEPC基

7、因擬南芥光合速率增加6.5-35.1％，平均增加18.9％，雙基因(PPDK+PEPC)擬南芥光合速率增加12.6-45.7％，平均增加26.3％。
　　 5.轉單個C4關鍵酶基因加速了C4微循環(huán)。T4代轉基因擬南芥酶活測定表明：PK17-1-2、PK26-3-2的PEPC酶活分別比對照增加18.65％和46.37％，與對照差異極顯著；PC65-4-6、PC73-1-13的PPDK酶活分別比對照增加12.96％和26.54％，與

8、對照差異極顯著，說明轉PPDK基因擬南芥可引起PEPC活性增加，反之亦然；T4代轉基因擬南芥光合測定表明：PK17-1-2、PK26-3-2、PC65-4-6、PC73-1-3的光合速率分別比對照增加了13.14％、23.29％、18.14％、36.44％，達極顯著水平。
　　 6.PPDK、PEPC共表達有協同效應。雙基因株系PKC6-5-1的光合速率比PK26-3-2和PC73-1-3的高，但是PKC6-5-1的PEPC酶活