玉米C-,4-途徑關鍵酶(PEPC、PPDK)基因的克隆及PEPC基因?qū)π←湹倪z傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、小麥為我國的重要糧食作物，其生產(chǎn)能力及供需狀況始終關系到我國國民經(jīng)濟發(fā)展和糧食安全等重大戰(zhàn)略問題。隨著我國社會經(jīng)濟的發(fā)展和人口的增加，人們對于糧食的需求日益增長。光合作用是一切綠色植物物質(zhì)生產(chǎn)的基礎，因此，提高作物產(chǎn)量的關鍵是提高光能利用效率，從而提高單位面積的產(chǎn)量。C4植物如玉米、高粱、甘蔗等具有CO2濃縮機制，光補償點高，CO2補償點低，光呼吸弱，特別在高溫、干旱等逆境條件下，比C3植物小麥、水稻等有較高的光合效率。將C4途徑關鍵酶

2、基因引入C3植物以提高其光合效率和籽粒產(chǎn)量，一直是國內(nèi)外生物學研究領域的前沿問題。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是C4光合途徑中的關鍵酶，其主要分布在C4植物的葉肉細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，形成CO2的濃縮機制為維管束鞘細胞的C3途徑提供CO2，起“CO2泵”的作用。磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）催化的反應是C4代謝途徑中的限速步驟，是C4光合途徑過程中另一個備受關注的酶，此酶位于葉肉細胞的葉綠體中，催化CO2最初受體PEP的再生。許

3、多研究已表明，將C4型pepc基因轉(zhuǎn)入C3作物可以提高C3作物的光合效率和產(chǎn)量潛力。 為獲得具有C4光合特征的高光效轉(zhuǎn)基因小麥新品系，從光合效率和PEPC酶活性均較高的玉米自交系2561中克隆出C4型pepc基因和ppdk基因的cDNA，通過基因槍介導法將玉米C4型pepc基因?qū)氲叫←溨?，為提高小麥品種的光合效率和轉(zhuǎn)基因高光效育種提供必要的理論和技術材料支撐。主要結(jié)果如下： 1．利用同源克隆技術，從玉米中克隆了C4型磷

4、酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的cDNA。PEPC的核苷酸序列分析表明，該片段全長3053bp，包含一個2910bp長的開放閱讀框，編碼970個氨基酸。與已登陸的玉米pepc基因（X15238）相比，序列同源性可達99％。核苷酸序列中存在16處堿基差異，導致蛋白質(zhì)水平上有5處非連續(xù)性排列的氨基酸差異，并未影響到該酶的酶活性。編碼區(qū)核苷酸序列與甘蔗C4型、高粱C4型、谷子C4型同源率分別達到91％、90．2％、83．2％，與水稻C3

5、型、高粱C3型、谷子C3型、稗草C3型同源率分別為74．1％、75．1％、76，8％、75．7％。氨基酸序列進化樹分析表明，所克隆的玉米C4型PEPC與甘蔗和高梁的C4型遺傳距離最近，而與谷子C4型次之。編碼蛋白質(zhì)的功能位點分析表明，玉米PEPC蛋白質(zhì)氨基酸序列有7個保守區(qū)。 2．利用同源克隆技術，從玉米中克隆了C4型磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）基因的cDNA。PPDK序列測定結(jié)果表明，PCR合成片段長度為3014bp，包括一個

6、2757bp長的開放閱讀框。與已登陸的玉米ppdk基因（J03901）相比，序列同源性可達92．94％， 3．利用從玉米中克隆的C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因（GenBank接受號為FJ415327）構(gòu)建高效雙元表達載體。將玉米C4型PEPC cDNA序列插入雙元表達載體pCAMBIA3301中，構(gòu)建了p3301-pepc融合表達載體。 4．利用基因槍介導法將p3301-pepc高效表達載體導入6個小麥品種

7、（系）中，共獲得409株抗性再生植株，其中有357株PCR擴增結(jié)果呈陽性。Southern雜交結(jié)果表明玉米C4型pepc基因已整合到小麥基因組中。利用實時熒光定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因小麥植株的拷貝數(shù)，在15株轉(zhuǎn)基因植株中7株拷貝數(shù)為1，3株拷貝數(shù)為2，2株拷貝數(shù)為3，拷貝數(shù)為5、8和17的分別為1株。RT-PCR分析結(jié)果表明外源基因在小麥基因組中得到正確轉(zhuǎn)錄，且不同轉(zhuǎn)基因植株pepc基因的表達量存在較大差異。 5．對T1代轉(zhuǎn)基因

8、小麥植株進行PCR檢測和遺傳分析，結(jié)果表明大部分轉(zhuǎn)基因植株的分離比例符合孟德爾顯性單基因遺傳分離規(guī)律，外源基因在T0代轉(zhuǎn)基因植株中整合情況良好，而且能夠穩(wěn)定的遺傳給后代；對T1代部分轉(zhuǎn)基因植株進行PEPC酶活性測定，結(jié)果顯示部分轉(zhuǎn)基因植株的PEPC酶活性得到了提高，最高的酶活性是對照植株的2．17倍，SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果表明不同轉(zhuǎn)基因植株間pepc基因表達水平存在差異，酶活性較高的轉(zhuǎn)基因植株，其pepc基因表達水平亦高；對田