基因槍介導(dǎo)玉米pepc基因轉(zhuǎn)入小麥的研究.pdf

1、本研究選取在黃淮麥區(qū)具有一定生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的16份小麥品種(系)，通過比較不同基因型幼穗和幼胚愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化的差異，篩選出組培特性較好，綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因受體基因型；構(gòu)建含有g(shù)us基因和bar基因的高光效表達(dá)載體；研究幼胚愈傷組織對(duì)潮霉素和L-PPT(草丁膦)的敏感性，確定了合適的選擇濃度；研究基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚的影響因素并對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行了檢測(cè)。 本研究獲得了如下結(jié)果： 1．小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體基因型的篩選

2、 1．1幼穗培養(yǎng)篩選結(jié)果 將供試的16個(gè)小麥材料的幼穗接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不同基因型出愈時(shí)間沒有明顯差異。不同基因型衍生的愈傷組織質(zhì)量差異較為明顯。不同基因型的幼穗愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異。增殖率率在四次繼代過程中存在顯著差異，K35幼穗愈傷組織增殖率在四次繼代過程中一直保持最高；周19、01H186-20-24、2000H841-15-1-3、2000 H 1012-2-1-5、鄭麥9023愈傷組織生長(zhǎng)較快，增殖率在四

3、次繼代過程中均較高。幼穗愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化時(shí)，不同基因型愈傷組織綠點(diǎn)分化率和綠苗分化率在四次繼代過程中存在顯著差異。繼代培養(yǎng)過程中，16個(gè)基因型的分化頻率均有一定程度的下降，但各基因型之間下降的幅度不同，從而在分化能力的保持方面表現(xiàn)出——定的差異。周19、2000H863-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5、K35幼穗愈傷組織綠點(diǎn)分化率在1-4次繼代過程中均較高；周19、2000H8

4、63-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5幼穗愈傷組織綠苗分化率在1-4次繼代過程中均較高。 1．2幼胚培養(yǎng)篩選結(jié)果 將供試的16個(gè)小麥材料的幼胚接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不同基因型出愈時(shí)間存在差異。不同基因型衍生的愈傷組織質(zhì)量差異較為明顯。各基因型幼胚出愈率沒有差異。經(jīng)過四次繼代后各基因型幼胚愈傷組織增殖率存在明顯差異，觀35、周19、01H186-20-24、2000H841-15-

5、1-3、2000 H 1012-2-1-5其愈傷組織生長(zhǎng)較快，增殖率在四次繼代過程中均較高。幼胚愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化時(shí)，周19、01H186-20-24、2000H863-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5、K35幼胚愈傷組織綠點(diǎn)分化率在1-4次繼代過程中均較高；周19、2000H863-13-4-4、2000H1012-2-1-5幼胚愈傷組織綠苗分化率在1-4次繼代過程中均較高，且叢

6、生苗較多，生長(zhǎng)健壯。綜合幼穗、幼胚試驗(yàn)結(jié)果，周19和2000H1012-2-1-5的組織培養(yǎng)特性較好，可作為小麥離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因受體材料的優(yōu)良基因型。16個(gè)基因型的幼穗和幼胚在四次繼代的過程中，出愈率和增殖率并無顯著差異，但幼胚愈傷組織分化綠苗率明顯高于幼穗愈傷組織分化綠苗率，且幼穗取材數(shù)量受限制，因此我們認(rèn)為幼胚比幼穗更適合作為小麥組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。 2．高光效表達(dá)載體的構(gòu)建 將來自C<,4>作物(玉米)光合

7、作用中的高光效基因pepc基因插入到植物表達(dá)質(zhì)粒pPPC中，獲得了攜帶gus基因和bar基因的植物表達(dá)載體pPC46。經(jīng)酶切和PCR檢測(cè)，證明載體構(gòu)建成功。 3．小麥幼胚愈傷組織對(duì)潮霉素和L-PPT敏感性試驗(yàn) 周19和2000H1012-2-1-5對(duì)潮霉素濃度敏感性不同。周19對(duì)潮霉素的耐受性比2000H1012-2-1-5強(qiáng)。潮霉素110 mg/L是周19小麥幼胚愈傷組織比較理想的篩選濃度。潮霉素80 mg/L是200

8、0H1012-2-1-5小麥幼胚愈傷組織比較理想的篩選濃度。 周19和2000H1012-2-1-5幼胚愈傷組織接入附加不同濃度L-PPT的繼代培養(yǎng)基，各處理之間幼胚愈傷組織的生長(zhǎng)沒有明顯差異。轉(zhuǎn)入附加L-PPT的分化培養(yǎng)基中，同一基因型各處理之間幼胚愈傷組織在分化階段對(duì)L-PPT的敏感性差異明顯，L-PPT6mg/L是周19和2000H1012-2-1-5幼胚愈傷組織比較理想的分化篩選濃度。 4．基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚影響

9、因素研究 以gus基因的瞬時(shí)表達(dá)和愈傷組織的綠芽分化率作為評(píng)價(jià)基因槍轟擊效果的衡量指標(biāo)，對(duì)影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的轟擊參數(shù)：轟擊壓力、轟擊距離、金粉用量、轟擊次數(shù)等進(jìn)行了研究。結(jié)合GUS染色結(jié)果和愈傷組織的綠芽率，基因槍轉(zhuǎn)化2000H1012--2-1-5合適的轟擊壓力是900psi，轟擊距離是9cm，金粉用量是250μg/槍，轟擊次數(shù)是1次。 5．抗性植株的檢測(cè) 采用pPC46表達(dá)載體和經(jīng)優(yōu)化的基因槍轟擊參數(shù)進(jìn)行基