基因槍法介導(dǎo)擬南芥AtMYB44基因轉(zhuǎn)化小麥的研究.pdf

1、普通小麥（TriticumaestivumL.）是禾谷類家族中最為重要的成員之一，是全球總產(chǎn)量最多、種植面積最廣的糧食作物。在世界糧食問題日趨嚴重的今天，提高小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)對緩解糧食短缺問題具有重要的實際意義。目前，利用基因工程技術(shù)的手段對小麥進行遺傳改良，提高小麥的產(chǎn)量、改善小麥的品質(zhì)、增強小麥對病蟲害以及各種非生物脅迫的抵抗性，是小麥遺傳育種中十分重要的發(fā)展方向。
　　 基因槍法是小麥遺傳轉(zhuǎn)化中最為廣泛使用的一種方法，它具

2、有無宿主限制、靶受體類型廣泛、可控度高、操作簡便快捷等優(yōu)點。本研究采用基因槍轉(zhuǎn)化法，將具有抗旱、抗寒及耐鹽功能的擬南芥AtMYB44基因轉(zhuǎn)入小麥品種揚麥158中，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.建立并優(yōu)化了揚麥158的高效再生體系。
　　 通過添加2,4-D濃度的梯度實驗，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2,4-D的濃度為2mg·L-1時，小麥幼胚的愈傷出愈率為最高的100％，且誘導(dǎo)出的愈傷組織較為致密，顏色為淡黃色，長勢旺盛。通過

3、添加不同濃度KT、IAA配比的比較實驗，發(fā)現(xiàn)在分化培養(yǎng)基中激素添加為KT1.0mg.L-1和IAA0.5mg.L-1時，愈傷組織的分化率為最高的93.3％，且綠點數(shù)及叢生芽數(shù)都相比較高。最終確定本研究中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/L2，4-D;分化培養(yǎng)基為MS+1.0mg/LKT+0.5mg/LIAA。
　　 2.利用綠色熒光蛋白基因(GFP)作為標記基因，對基因槍的主要參數(shù)（轟擊距離和鎢粉/DNA用量）進行了優(yōu)化。
　

4、　 結(jié)果表明轟擊距離為8cm時，GFP的瞬時表達率為最高的37.1％，且平均熒光細胞數(shù)也為最多的13.5個;鎢粉/DNA用量為600μg/1μg時，GFP的瞬時表達率為最高的35.4％，且平均熒光細胞數(shù)也為最多的12.8個。最終確定了針對揚麥158幼胚愈傷組織的基因槍轉(zhuǎn)化最佳轟擊條件:轟擊距離為8cm，鎢粉/DNA的用量為600μg/1μg，氦氣壓力為7.5MPa，破裂膜為7MPa，真空度為0.095MPa，鎢粉直徑1μm。
　

5、　 3.用基因槍法將擬南芥的AtMYB44基因?qū)氲綋P麥158中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，目的基因轉(zhuǎn)化率為0.67％。
　　 本研究中共轟擊了1044塊愈傷組織，經(jīng)過分化培養(yǎng)產(chǎn)生綠點的愈傷組織數(shù)為314塊，經(jīng)過生根壯苗培養(yǎng)，再生植株數(shù)為297株，其分化率和成苗率為分別為30.1％和28.4％;經(jīng)過煉苗，越夏處理，將再生植株全部移栽到實驗田中，最終成活了198株再生植株(To)，其移栽成活率為66％。提取再生植株的基因組DNA，分別對

6、目的基因AtMYB44和選擇標記基因Bar進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)有7株再生植株的PCR檢測結(jié)果呈陽性，并將目的基因AtMYB44的PCR產(chǎn)物片段進行克隆測序，結(jié)果比對正確，最終獲得了7株轉(zhuǎn)基因小麥植株。
　　 4.對轉(zhuǎn)基因小麥其中一個株系M-141的7株T1代植株進行了PCR檢測，結(jié)果顯示7株均擴增出預(yù)期大小的DNA條帶。
　　 本研究通過基因槍法將目的基因轉(zhuǎn)入到小麥品種揚麥158的愈傷組織，經(jīng)抗性篩選、分化再生得到再生植