基因槍法介導(dǎo)擬南芥AtMYB44基因轉(zhuǎn)化小麥的研究.pdf

1、普通小麥（TriticumaestivumL.）是禾谷類(lèi)家族中最為重要的成員之一，是全球總產(chǎn)量最多、種植面積最廣的糧食作物。在世界糧食問(wèn)題日趨嚴(yán)重的今天，提高小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)對(duì)緩解糧食短缺問(wèn)題具有重要的實(shí)際意義。目前，利用基因工程技術(shù)的手段對(duì)小麥進(jìn)行遺傳改良，提高小麥的產(chǎn)量、改善小麥的品質(zhì)、增強(qiáng)小麥對(duì)病蟲(chóng)害以及各種非生物脅迫的抵抗性，是小麥遺傳育種中十分重要的發(fā)展方向。
　　 基因槍法是小麥遺傳轉(zhuǎn)化中最為廣泛使用的一種方法，它具

2、有無(wú)宿主限制、靶受體類(lèi)型廣泛、可控度高、操作簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用基因槍轉(zhuǎn)化法，將具有抗旱、抗寒及耐鹽功能的擬南芥AtMYB44基因轉(zhuǎn)入小麥品種揚(yáng)麥158中，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.建立并優(yōu)化了揚(yáng)麥158的高效再生體系。
　　 通過(guò)添加2,4-D濃度的梯度實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2,4-D的濃度為2mg·L-1時(shí)，小麥幼胚的愈傷出愈率為最高的100％，且誘導(dǎo)出的愈傷組織較為致密，顏色為淡黃色，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。通過(guò)

3、添加不同濃度KT、IAA配比的比較實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在分化培養(yǎng)基中激素添加為KT1.0mg.L-1和IAA0.5mg.L-1時(shí)，愈傷組織的分化率為最高的93.3％，且綠點(diǎn)數(shù)及叢生芽數(shù)都相比較高。最終確定本研究中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/L2，4-D;分化培養(yǎng)基為MS+1.0mg/LKT+0.5mg/LIAA。
　　 2.利用綠色熒光蛋白基因(GFP)作為標(biāo)記基因，對(duì)基因槍的主要參數(shù)（轟擊距離和鎢粉/DNA用量）進(jìn)行了優(yōu)化。
　

4、　 結(jié)果表明轟擊距離為8cm時(shí)，GFP的瞬時(shí)表達(dá)率為最高的37.1％，且平均熒光細(xì)胞數(shù)也為最多的13.5個(gè);鎢粉/DNA用量為600μg/1μg時(shí)，GFP的瞬時(shí)表達(dá)率為最高的35.4％，且平均熒光細(xì)胞數(shù)也為最多的12.8個(gè)。最終確定了針對(duì)揚(yáng)麥158幼胚愈傷組織的基因槍轉(zhuǎn)化最佳轟擊條件:轟擊距離為8cm，鎢粉/DNA的用量為600μg/1μg，氦氣壓力為7.5MPa，破裂膜為7MPa，真空度為0.095MPa，鎢粉直徑1μm。
　

5、　 3.用基因槍法將擬南芥的AtMYB44基因?qū)氲綋P(yáng)麥158中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，目的基因轉(zhuǎn)化率為0.67％。
　　 本研究中共轟擊了1044塊愈傷組織，經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)產(chǎn)生綠點(diǎn)的愈傷組織數(shù)為314塊，經(jīng)過(guò)生根壯苗培養(yǎng)，再生植株數(shù)為297株，其分化率和成苗率為分別為30.1％和28.4％;經(jīng)過(guò)煉苗，越夏處理，將再生植株全部移栽到實(shí)驗(yàn)田中，最終成活了198株再生植株(To)，其移栽成活率為66％。提取再生植株的基因組DNA，分別對(duì)

6、目的基因AtMYB44和選擇標(biāo)記基因Bar進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有7株再生植株的PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，并將目的基因AtMYB44的PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行克隆測(cè)序，結(jié)果比對(duì)正確，最終獲得了7株轉(zhuǎn)基因小麥植株。
　　 4.對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥其中一個(gè)株系M-141的7株T1代植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示7株均擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA條帶。
　　 本研究通過(guò)基因槍法將目的基因轉(zhuǎn)入到小麥品種揚(yáng)麥158的愈傷組織，經(jīng)抗性篩選、分化再生得到再生植