黑麥草離體再生體系的建立和基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、黑麥草是禾本科黑麥草屬植物，被廣泛用作草坪草和牧草，利用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行遺傳改良研究一直備受人們關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)在建立高效的多年生黑麥草離體再生體系的基礎(chǔ)上，通過基因槍法轉(zhuǎn)移bar基因，獲得了多年生黑麥草的轉(zhuǎn)基因植株，為黑麥草品種的改良提供了新的途徑。 一、黑麥草離體再生體系的建立經(jīng)過對(duì)比試驗(yàn)，以成熟胚為外植體，成功地建立了黑麥草的再生體系，篩選出適合于黑麥草成熟胚的再生培養(yǎng)基配方。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS基本培養(yǎng)基

2、+5mg/L 2,4-D為最佳，胚性愈傷組織誘導(dǎo)頻率為23.8％；分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1mg/L6-BA，分化頻率可以達(dá)到33.3％。 二、多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立對(duì)愈傷組織進(jìn)行除草劑Bialaphos敏感性試驗(yàn)，確定了篩選愈傷組織的最佳選擇壓為2mg/L，在此基礎(chǔ)上建立了多年生黑麥草胚性愈傷組織的基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化體系。實(shí)驗(yàn)過程中，首先在含有甘露醇和山梨醇各0.25mol/L的MS培養(yǎng)基上對(duì)生長(zhǎng)旺盛的胚性愈傷組織進(jìn)

3、行5～12個(gè)小時(shí)的高滲處理，然后實(shí)施基因槍轟擊。轟擊時(shí)的真空度為28英寸汞柱，氦氣氣壓為1350psi，每槍的金粉用量為500μ/L。轟擊16小時(shí)后將愈傷組織轉(zhuǎn)入附加Bialaphos的培養(yǎng)基中，經(jīng)過三輪(各10天)選擇培養(yǎng)，得到抗性愈傷組織。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，20天左右后陸續(xù)有再生苗長(zhǎng)出。將再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，長(zhǎng)出壯根后移栽。PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)bar基因已整合至黑麥草基因組中，同時(shí)進(jìn)行了gus基因的表達(dá)分析。在得到的3