銀杏萜內(nèi)酯代謝途徑中關鍵酶基因的遺傳轉化研究.pdf

1、銀杏萜內(nèi)酯,包括銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯,是在銀杏提取物中起著主要作用的有效藥用成分,其獨特的生理作用和治療價值在世界醫(yī)療行業(yè)引起了極大興趣。然而,銀杏萜內(nèi)酯在銀杏中含量較低,且銀杏的細胞培養(yǎng)系很少產(chǎn)銀杏萜內(nèi)酯。由于不斷擴大的銀杏制品的市場需求和有限的銀杏樹資源,用基因工程技術修飾銀杏萜內(nèi)酯生物合成途徑已成為提高銀杏萜內(nèi)酯含量最具潛力的方法之一。法尼基焦磷酸合成酶(FPS)是異戊烯基轉移酶中的一種,它催化一分子的二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP

2、)和兩分子的異戊烯基焦磷酸(IPP)縮合生成法尼基焦磷酸(FPP)。FPP是植物體內(nèi)甾體、皂苷、倍半萜、橡膠等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體。在銀杏中,FPP為合成白果內(nèi)酯合成提供前體,同時也為香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的生成提供直接前體,而GGPP是包括銀杏內(nèi)酯在內(nèi)的所有二萜類化合物的共同前體。1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸還原酶(HDR)是MEP途徑末端的酶,以5:1的比例同時把1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁

3、烯基-4-焦磷酸(HMBPP)轉化成IPP和DMAPP的混合物,為銀杏萜內(nèi)酯的生物合成提供了異戊烯前體。FPS和HDR都是銀杏內(nèi)酯合成途徑中的關鍵酶。因此,fps基因和hdr基因也成為了研究銀杏內(nèi)酯代謝工程的兩個潛在靶點。為了研究FPS和HDR對銀杏愈傷中銀杏內(nèi)酯含量的影響,我們基于pCAMBIA1304載體構建了兩個單基因表達載體,分別是載體p1304+Gbfps和載體p1304+Gbhdr。采用根癌農(nóng)桿菌介導法,分別將Gbfps和G

4、bhdr轉化銀杏種子胚。通過潮霉素(10mg/L)篩選,分別獲得了32個和8個抗性愈傷組織系,PCR檢測表明其中分別有30個和7個為轉基因愈傷組織系。采用HPLC-ELSD法分別對轉Gbfps的22個愈傷組織和轉Gbhdr的4個愈傷組織中的銀杏總內(nèi)酯含量進行了測定。結果顯示,轉Gbfps的愈傷組織系f-6中銀杏總內(nèi)酯含量相比非轉基因系有大幅提高,達到非轉基因系的4.4倍,轉Gbhdr的愈傷組織系h-8中銀杏總內(nèi)酯含量達到非轉基因系的2.