菊花Na~+-H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆、功能驗(yàn)證及表達(dá)分析.pdf

1、土壤中過(guò)多的鹽分是影響植物正常發(fā)育生長(zhǎng)的非生物脅迫性因素之一。土壤中過(guò)多的Na~+對(duì)植物的脅迫作用主要表現(xiàn)在水分虧缺、Ka~+/Na~+比率的改變及Na~+、Cl~-濃度改變?cè)斐傻碾x子脅迫,從而造成植株體內(nèi)離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡破壞、代謝紊亂,并由此導(dǎo)致植株的生長(zhǎng)和發(fā)育受到影響。植物耐鹽的機(jī)制主要包括滲透調(diào)節(jié)和降低胞質(zhì)內(nèi)Na~+水平。降低Na~+的吸收、外排Na~+和區(qū)隔化Na~+是植物保持胞質(zhì)內(nèi)低Na~+濃度的策略。其中的Na~+的外排和區(qū)隔

2、化是間接的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程,主要由Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)。Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)菌、藻類(lèi)、動(dòng)物和高等植物膜系統(tǒng)上普遍存在的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,參與細(xì)胞內(nèi)的Na~+濃度、pH調(diào)節(jié)及細(xì)胞體積變化等生命活動(dòng),其在細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上均有分布。液泡膜上的Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞質(zhì)中的Na~+逆Na~+濃度梯度運(yùn)送到液泡中進(jìn)而將Na~+區(qū)隔化集中。Na~+的區(qū)隔化還可降低細(xì)胞水勢(shì),抵抗鹽分造成的滲透脅迫。自液泡型Na~+/H~+

3、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因首次從擬南芥中克隆出來(lái)后,對(duì)于該基因的研究日趨深入,大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,向植物轉(zhuǎn)入Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可以顯著提高植物的耐鹽性。菊花原產(chǎn)我國(guó),是四大名花之一,有些品種還具有一定的藥用價(jià)值。雖然有個(gè)別菊花對(duì)鹽脅迫有一定的耐受,但大部分觀(guān)賞價(jià)值高的菊花對(duì)鹽漬和干旱脅迫敏感。若想在更廣大區(qū)域,特別是鹽堿地較多的地區(qū)大面積種植,還需要培育耐鹽能力更強(qiáng)的菊花新品種。因此需要對(duì)其耐鹽性狀進(jìn)行研究,從而更好地利用基因工程

4、的手段對(duì)其進(jìn)行改造。目前,對(duì)于菊花中克隆耐鹽性有關(guān)基因的研究尚處于起步階段,鮮有研究報(bào)道。因此,鑒定出與菊花耐鹽性相關(guān)的主效基因特別是Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因就顯得非常重要和迫切。本研究通過(guò)同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,利用RT-PCR及RACE技術(shù),首次從菊花中克隆出Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因DmNHX1。序列分析表明,DmNHX1全長(zhǎng)1897bp,包括18bp的5′非翻譯區(qū),202bp的3′非翻譯區(qū)和1653bp的開(kāi)放閱讀

5、框。此cDNA可編碼含550個(gè)氨基酸的多肽,推測(cè)分子量為61.1KDa,含有Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高度保守序列LFFIYLLPPI。經(jīng)過(guò)同源序列比較及進(jìn)化關(guān)系分析,推斷DmNHX1的編碼產(chǎn)物為液泡型Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與擬南芥、水稻液泡型Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源性分別達(dá)73％和76%。疏水性分析表明,該基因編碼的多肽鏈有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,為此類(lèi)蛋白的典型結(jié)構(gòu)。利用酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因的功能,將DmNHX1轉(zhuǎn)入

6、鹽敏感的酵母突變株(Δnhx1)使得菌株分別可以在含有400mM的NaCl、1M KCl、100mM LiCl和HYG(50μg/mL)的培養(yǎng)基中部分恢復(fù)生長(zhǎng),證明該基因有一定的耐鹽功能。將菊花植株經(jīng)150mM NaCl鹽溶液處理13天后,利用熒光定量PCR和原子吸收光譜測(cè)定分析鹽處理前后DmNHX1在mRNA水平上表達(dá)變化及組織特異性、Na~+含量的變化及組織分布。熒光定量PCR的結(jié)果顯示,鹽處理后DmNHX1在根、莖、葉和花四個(gè)部位

7、的表達(dá)均有上調(diào),分別為對(duì)照組的2.04、1.13、3.53和1.17倍。原子吸收光譜測(cè)定Na~+對(duì)照組在根、莖、葉和花四個(gè)部分的含量分別為0.76%、1.00%、1.10%和1.40%,鹽處理后的實(shí)驗(yàn)組四個(gè)部位的Na~+含量分別為1.30%、1.40%、3.20%和1.40%。熒光定量PCR與Na~+含量測(cè)定的結(jié)果表明,鹽脅迫使得DmNHX1表達(dá)量增加,進(jìn)而區(qū)隔化更多的Na~+于液泡中,導(dǎo)致Na~+含量的增加。各個(gè)部位增加的程度不同揭示