菊芋Na+-H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆及在水稻中抗鹽的功能分析.pdf

1、鹽漬化是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最主要的限制因子之一。植物的鹽脅迫主要由鈉離子(Na+)引起，過高的Na+會引起離子毒害、滲透脅迫及K+/Na+比率的不平衡使植物新陳代謝異常，從而對植物器官造成傷害。因此鹽脅迫條件下，為了減輕Na+的危害，植物細(xì)胞依靠質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白將Na+排出體外，或者通過液泡膜上的Ua+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白把Na+區(qū)隔化到液泡中，從而維持細(xì)胞質(zhì)中正常的離子均衡。
　　菊芋(Helianthustubero

2、susL.)屬菊科向日葵屬草本植物，是集耐鹽堿、耐貧瘠、耐旱、抗病蟲于一體的能源植物，有著極高的推廣應(yīng)用和研究價值。本論文從強(qiáng)耐鹽菊芋品種南菊芋1號中克隆了2種離子轉(zhuǎn)運蛋白基因:質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因HtSOS1和液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因HtNHX1/2，并對它們的序列進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，將HtSOS1和HtNHX1/2基因在酵母和水稻中過量表達(dá)，對轉(zhuǎn)化體的耐鹽功能進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
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3、.通過同源基因克隆的方法從菊芋中克隆到質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因HtSOS1的cDNA全序列(GenBankaccessionno.KC410809)，該基因全長3858bp，具有372bp的5’端非編碼區(qū)和96bp的3’端非編碼區(qū)，ORF為3390bp，預(yù)測編碼一條1129個氨基酸組成的多肽鏈，預(yù)測蛋白分子量為124KDa。HtSOS1與已克隆的其他植物SOS基因具有較高的同源性。同源序列比對發(fā)現(xiàn)HtSOS1與大島野路菊CcS

4、OS1，葡萄VvSOS1，水稻OsSOS1和擬南芥AtSOS1的同源性比較高，分別達(dá)到83％,70％,64％和62％?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明，HtSOS1具有12個明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和一個近700個氨基酸組成的C-端非跨膜尾巴。通過HtSOS1-GFP在水稻原生質(zhì)體中進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗分析，結(jié)果顯示HtSOS1定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。
　　2.用q-RT-PCR方法分析了HtSOS1在不同NaC1濃度及NaC1處理不同時間下的表達(dá)模式。在沒有

5、鹽脅迫條件下，HtSOS1在菊芋根、莖、葉中都有表達(dá)，而在鹽脅迫下表達(dá)均上調(diào)，且在根和莖中的上調(diào)程度遠(yuǎn)大于葉片中。在菊芋全生育期中HtSOS1在根、莖、葉和塊莖中均有表達(dá)。
　　3.構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-HtSOS1和空載體，并轉(zhuǎn)化到酵母鹽敏感突變體AXT3中，然后在含不同NaCl濃度的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果顯示HtSOS1酵母轉(zhuǎn)化子在含較高濃度NaCl的培養(yǎng)基上生長情況明顯優(yōu)于空載體酵母轉(zhuǎn)化子，表明HtSOS1酵母轉(zhuǎn)化子可能通

6、過外排過多的Na+到酵母細(xì)胞外從而增強(qiáng)了酵母鹽敏感突變體的耐鹽能力。
　　4.為了進(jìn)一步研究HtSOS1的功能，我們構(gòu)建了pTCK303-HtSOS1植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將HtSOS1基因組成型表達(dá)在日本晴水稻中。RT-PCR分析表明HtSOS1基因已經(jīng)整合到水稻基因組中并在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。耐鹽生理實驗表明HtSOS1轉(zhuǎn)基因水稻其耐鹽能力得到了一定程度的提高:轉(zhuǎn)基因水稻在100mMNaCl的營養(yǎng)液中處理21天后比野生

7、型具有顯著高的鮮重、相對含水量、K+含量及K+/Na+比例，體內(nèi)Na+濃度相對野生型顯著降低。表明HtSOS1可能具有外排細(xì)胞中過多的Na+從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽能力。
　　5.通過同源基因克隆的方法從菊芋中克隆得到2個液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因HtNHX1/2cDNA全序列。HtNHX1和HtNHX2cDNA全長分別為2148bp和1806bp，它們具有相同的269bp的5’端非編碼區(qū)和501bp的3’端非編碼區(qū)，

8、ORF分別為1650bp和1308bp，分別編碼兩條549和435個氨基酸的多肽，其中HtNHX2除了比HtNHX1缺失連續(xù)的114個氨基酸外，其余部分完全相同。HtNHX1和HtNHX2氨基酸序列都有一段高度保守的液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活力的競爭性抑制劑氨氯吡嗪嘧的結(jié)合位點(85)LFFIYLLPPI(94)序列?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果顯示HtNHX1具有10個典型的跨膜區(qū)域，而HtNHX2只有7個或8個跨膜區(qū)。HtNHX1與

9、已鑒定的植物NHX1氨基酸序列有較高的同源性。將HtNHX1/2融合GFP后在酵母和洋蔥表皮中表達(dá)，分析HtNHX1/2在細(xì)胞中的定位，結(jié)果顯示HtNHX1/2均定位在液泡膜上。
　　6.用RT-PCR及qRT-PCR研究了HtNHX1/2在不同NaCl濃度及NaCl處理不同時間下的表達(dá)模式。在沒有鹽脅迫的條件下，菊芋根、莖和葉中HtNHX1/2都有表達(dá)，而在鹽脅迫下兩者的表達(dá)均上調(diào)，并且在根和莖中的上調(diào)程度大于葉片中，表明HtN

10、HX1/2的表達(dá)具有組織特異性。在菊芋全生育期中，HtNHX1/2在根、莖、葉和塊莖中均有表達(dá)。
　　7.構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2-HtNHX1/2，并將其與空載體pYES2轉(zhuǎn)化到酵母鹽敏感突變體AXT3中，然后在含不同NaCl濃度的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果顯示HtNHX1/2酵母轉(zhuǎn)化子在含較高濃度NaCl的培養(yǎng)基上生長情況明顯優(yōu)于空載體酵母轉(zhuǎn)化子，表明HtNHX1/2酵母轉(zhuǎn)化子可能通過區(qū)隔過多的Na+到酵母液泡中從而增強(qiáng)了酵母鹽敏感

11、突變體的耐鹽能力。
　　8.為了進(jìn)一步研究HtNHX1和HtNHX2的生理功能，我們構(gòu)建了pTCK303-HtNHX1/2植物表達(dá)載體，并通過組成型啟動子在水稻日本晴品種中表達(dá)。通過PCR、RT-PCR、qRT-PCR、TAIL-PCR及Southernblot等方法鑒定了HtNHX1和HtNHX2基因各自單拷貝純合插入能穩(wěn)定遺傳的多個轉(zhuǎn)基因株系。耐鹽生理實驗表明，在高濃度NaCl脅迫下，與野生型和轉(zhuǎn)HtNHX1基因的水稻相比，轉(zhuǎn)