甜菜液泡膜Na+-H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BvNHX基因克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、土壤鹽堿化是影響農(nóng)作物質(zhì)量和產(chǎn)量的非生物脅迫之一。在鹽脅迫條件下液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)植物的生存具有重要的作用，可以將細(xì)胞質(zhì)中過(guò)多的Na+區(qū)域化至液泡中，以減輕對(duì)細(xì)胞質(zhì)的離子毒害，并維持細(xì)胞中離子與滲透勢(shì)的平衡，提高植物的耐鹽性。因此，克隆液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因并對(duì)其功能進(jìn)行研究變得非常有必要。
　　本文以甜菜（Beta vulgaris L.）為材料，克隆甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BvNHX的

2、全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建其超表達(dá)載體和RNAi載體，初步探討該基因在甜菜Na+區(qū)域化中的功能，取得了如下結(jié)果：
　?。?）在200～300mmol/L NaCl處理下，相比與四倍體（TY03410）二倍體（TY03209）地上部與根部積累較多Na+，而K+的含量沒(méi)有顯著性差異，在50～300mmol/L NaCl處理下兩者的K+/Na+沒(méi)有顯著性差異，100mmol/L NaCl處理使二倍體（TD85ms）的鮮重相對(duì)生長(zhǎng)率高于四倍體（T

3、Y03410），但兩者K+/Na+在50～300mmol/L NaCl處理下沒(méi)有顯著性差異，可見(jiàn)四倍體與二倍體的耐鹽性沒(méi)有顯著性差異；在100mmol/L NaCl處理下，四倍體（TY03410）和二倍體（TD85ms）地上部與根部干重、鮮重和Na+含量隨著處理時(shí)間的增加呈遞增趨勢(shì)，但根部在處理72h、地上部處理120h后兩者K+/Na+沒(méi)有顯著性差異。
　?。?）根據(jù)已知其它植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，

4、利用RACE方法，克隆得到甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BvNHX基因的全長(zhǎng)cDNA，其全長(zhǎng)為2284bp，包括1653bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），19bp的5'非翻譯區(qū)（5'UTR），以及612bp的3'非翻譯區(qū)（3'UTR），其中包含25bp的poly(A)尾巴，編碼552個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為61.34kD，等電點(diǎn)為6.609。含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，位于第三個(gè)跨膜區(qū)的氨氯吡嗪咪（Amiloride）結(jié)合位點(diǎn)LFFYLLPPI與

5、其它物種有高的同源性。
　　（3）通過(guò)對(duì)甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BvNHX全長(zhǎng)序列的分析，選取大小為1653bp的一段序列做為目的序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，采用RT-PCR的方法克隆得到該片段，成功構(gòu)建BvNHX超表達(dá)載體pCAMBIA1302-BvNHX，利用凍融法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101。
　?。?）通過(guò)對(duì)23種植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因核苷酸序列比對(duì)，選擇保守性高的、長(zhǎng)度為500

6、bp的片段作為RNAi片段，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，用于擴(kuò)增構(gòu)建甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BvNHX基因干擾載體的正、反義片段，以中間載體pHANNIBAL和表達(dá)載體pART27為基礎(chǔ)，利用酶切連接法成功構(gòu)建BvNHX基因的干擾載體PARB。
　?。?）采用實(shí)生苗侵染法，獲得陽(yáng)性干擾植株，利用PCR法檢測(cè)pARB是否整合至植物基因組中，采用RT-PCR分析BvNHX基因是否沉默，結(jié)果表明，12株苗的BvNHX不同程度