小麥Na+-H+逆轉(zhuǎn)蛋白的功能分析.pdf

1、目前鹽脅迫已成為重要的非生物脅迫之一，土壤鹽漬化對農(nóng)業(yè)的危害是一個全球性的問題。小麥屬淡土植物，其生長受到鹽脅迫的抑制，鹽害直接影響著小麥生產(chǎn)的發(fā)展。在鹽脅迫條件下，Na+會通過非特異性離子通道進入細胞內(nèi)，為了減輕Na+的危害，植物細胞通過質(zhì)膜上的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白把Na+排出體外，或者通過液泡膜上的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白把Na+區(qū)域化至液泡中，從而維持胞質(zhì)內(nèi)正常的離子均衡。本研究借助酵母(Saccharomycescerevisi

2、ae)突變體，對小麥質(zhì)膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白TaSOS1和小麥液泡膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白TaNHX2的耐鹽性和其Na+/H+離子轉(zhuǎn)運活性進行了分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．分子信息學的分析表明TaSOS1與擬南芥AtSOS1和水稻OsSOS1的同源性高，TaSOS1可能與AtSOS1和OsSOS1的功能相同，為質(zhì)膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白，可以將細胞內(nèi)過多的Na+排出體外。用熒光定量PCR的方法研究了TaSOS1的表達模

3、式，分析了TaSOS1對NaC1鹽脅迫、4℃低溫脅迫、ABA離子脅迫和PEG6000干旱脅迫的表達情況。在正常條件下，小麥根中TaSOS1的mRNA表達量高于葉中的表達量；鹽脅迫處理下，根中TaSOS1的特異性表達顯著，呈現(xiàn)出上調(diào)表達，而葉中的TaSOS1在不同時間內(nèi)的表達量差異不明顯，表明TaSOS1在根中的表達豐度較高，與組織特異性有關(guān)，在根中受鹽脅迫特異性表達。TaSOS1的表達不受ABA、PEG和低溫的影響，為非ABA依賴途徑。

4、
　　 2．構(gòu)建酵母表達載體pYPGE15-TaSOS1，用PEG/LiAc化學轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入酵母中，通過酵母功能互補驗證證實了TaSOS1可以部分互補酵母鹽敏感突變體AXT3K的耐鹽功能，能夠在AP+80mM NaCl的培養(yǎng)基上生長，而轉(zhuǎn)空載體的對照則表現(xiàn)為致死。在20mM NaC1脅迫之下，轉(zhuǎn)TaSOS1基因的酵母細胞體內(nèi)Na+含量比對照中顯著降低，證明了TaSOS1具有Na+轉(zhuǎn)運功能，可以把Na+排出體外，從而降低細胞內(nèi)Na

5、+的濃度。
　　 3．采用兩相法提純了轉(zhuǎn)TaSOS1基因和轉(zhuǎn)空載體酵母細胞的質(zhì)膜，根據(jù)H+-ATPase對各專一性抑制劑的敏感性來鑒定質(zhì)膜純度。Na3VO4對H+-ATPase活性敏感性最大，H+-ATPase活性降低了60％，而NaN3、KNO3、Na2MoO4對H+-ATPase活性與對照相比基本無影響，說明膜微囊制劑未被線粒體、液泡膜及磷酸酶污染，從酵母細胞中分離到的質(zhì)膜純度較高，去除了大部分雜膜。
　　 4．用熒

6、光猝滅的方法檢測了質(zhì)膜微囊內(nèi)外H+梯度的變化，以達到穩(wěn)態(tài)時每毫克膜蛋白所產(chǎn)生的熒光猝滅值計算跨膜H+梯度，進而檢測轉(zhuǎn)基因酵母細胞質(zhì)膜的Na+/H+轉(zhuǎn)運活性。結(jié)果表明含有TaSOS1基因的酵母細胞質(zhì)膜，其Na+/H+轉(zhuǎn)運活性要高于對照，Na+/H+轉(zhuǎn)運活性的差異與NaC1的耐性和離子含量的結(jié)果相吻合，證明了TaSOS1蛋白具有Na+/H+轉(zhuǎn)運活性，這種離子轉(zhuǎn)運功能在耐鹽過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 5．克隆了小麥液泡膜Na+/H+

7、逆轉(zhuǎn)運蛋白TaNHX2，TaNHX2與AtNHX1和AtNHX2同源性最高，說明了TaNHX2可能與小麥的耐鹽有關(guān)。Western blot結(jié)果表明，pYES2-TaNHX2可以在酵母中很好的表達。酵母功能互補實驗表明TaNHX2可以互補AXT3K對鹽的敏感性，能在含有30mM和60mM NaCl的AP培養(yǎng)基上正常生長，但其耐鹽性沒有達到野生型酵母的耐鹽性，同時TaNHX2可以提高轉(zhuǎn)基因酵母的耐鉀性，這說明TaNHX2不僅有轉(zhuǎn)運Na+的

8、功能，同時也有轉(zhuǎn)運K+的功能。研究了在NaCl脅迫條件下酵母細胞中的Na+、K+離子含量，在20mM NaC1脅迫條件下，含有TaNHX2的酵母細胞中Na+含量與對照相比沒有顯著差異，相反，K+含量差異達到極顯著水平。這可能是TaNHX2的耐鹽性不單是由于其轉(zhuǎn)運Na+，更重要的是由于K+在細胞內(nèi)的積累導致耐鹽性增強，這是目前報道的液泡膜NHX蛋白中第一個具有耐鉀功能的蛋白。
　　 6．為了驗證TaNHX2的cation/H+離子

9、交換以及離子區(qū)隔化的功能，提取了轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)空載體(對照)酵母突變體OC02的完整的液泡，對照OC02幾乎沒有K+/H+和Na+/H+的交換活性。轉(zhuǎn)TaNHX2的酵母可以把K+和Na+泵入液泡，且其K/H+交換活性遠大于Na+/H+交換活性，這與酵母中Na+、K+離子含量的結(jié)果完全吻合。從中可以推測出TaNHX2使K+泵入液泡從而使H+進入胞質(zhì)中，K+泵入液泡使得K+作為滲透劑維持細胞的膨壓促使水分進入細胞內(nèi)，K+的區(qū)隔化可以阻止有害的N