玉米寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ZOPTO212)的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、提高作物氮素利用效率對保障全球糧食安全起到舉足輕重的作用,圍繞作物氮素利用效率的研究已成為植物營養(yǎng)遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。植物分子生理學(xué)研究結(jié)果顯示,寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OPT)參與了植物氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與利用,對植物氮利用效率提高有著顯著的影響。本論文以我國第二大糧食作物玉米為研究對象,選用目前常規(guī)育種廣泛使用的骨干自交系掖478及以其為背景的3個導(dǎo)入系IL8、IL26、IL65為試驗(yàn)材料,采用RT-PCR克隆玉米寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,并進(jìn)行生物信息學(xué)分

2、析,通過亞細(xì)胞定位和半定量PCR進(jìn)行表達(dá)分析研究,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)玉米B73和水稻的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全長序列設(shè)計(jì)引物,通過RT-PCR直接擴(kuò)增的方法從玉米自交系掖478中克隆到了寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,命名為ZmOPT0212(基因登錄號:HM021150)。ZmOPT0212開放閱讀框?yàn)?151bp,編碼716個氨基酸殘基、等電點(diǎn)8.87、相對分子質(zhì)量為77.4kDa。
　　 2.生物信息學(xué)分析,寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)

3、蛋白其二級結(jié)構(gòu)約含43.85％的α-螺旋、3.91％的β-轉(zhuǎn)角、13.27％的延伸鏈和38.97％的不規(guī)則卷曲,含有14個連續(xù)的疏水片斷,其中12個可能構(gòu)成跨膜螺旋；預(yù)測該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不存在信號肽,可能存在于細(xì)胞膜上。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測編碼蛋白屬于OPT蛋白家族。通過蛋白功能預(yù)測,該蛋白具有轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)運(yùn)及與底物結(jié)合等功能。同源性和進(jìn)化樹的預(yù)測分析顯示,ZmOPT0212蛋白與水稻、擬南芥、毛果楊和蓖麻等高等植物的

4、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性分別達(dá)到了99％、96％、92％和92％。
　　 3.亞細(xì)胞定位,構(gòu)建融合表達(dá)載體35s-GFP-ZmOPT0212,用基因槍轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞觀察其在細(xì)胞中的定位,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜部位有明顯的熒光,初步證明ZmOPT0212位于細(xì)胞膜中。
　　 4.半定量分析結(jié)果表明,在非脅迫條件下,ZmOPT0212基因在幼嫩葉和根部都有表達(dá)。同樣方法分析在非生物脅迫條件下掖478及其三個導(dǎo)入系