黏蟲ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)與功能分析.pdf

1、黏蟲Mythimna separata(Walker)是一種多食性昆蟲，由于其具有遠(yuǎn)距離的遷飛習(xí)性，導(dǎo)致其在我國危害范圍廣，給我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著轉(zhuǎn)基因作物在全世界范圍大規(guī)模的推廣種植，在減少化學(xué)殺蟲劑的使用的同時(shí)也高效的控制住了相關(guān)害蟲的為害。現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因作物絕大部分是轉(zhuǎn)Bt（Bacillusthuringiensis）基因，因?yàn)槠洚a(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白對昆蟲有著特異性殺蟲作用，但隨著其對害蟲的選擇壓力的增加，相關(guān)害

2、蟲對Bt抗性問題已經(jīng)日益嚴(yán)峻，本研究則是以黏蟲為研究對象，在已經(jīng)獲得黏蟲ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MsABCC2(GenBank登錄號為KJ930171.1)和MsABCC3基因cDNA全長的基礎(chǔ)上，測定了該基因在幼蟲體內(nèi)不同齡期及不同組織中的相對表達(dá)量，同時(shí)使用RNAi(RNA interference)技術(shù)研究了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。主要結(jié)果如下:
　　1.黏蟲幼蟲MsABCC2和MsABCC3

3、蛋白基因的相對表達(dá)量
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以β-actin為內(nèi)參基因，結(jié)果采用2-△△CT分析方法，得到了幼蟲在不同齡期和不同組織中的MsABCC2和MsABCC3的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示:在不同齡期幼蟲中MsABCC2蛋白基因表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)。6齡幼蟲體內(nèi)的基因相對表達(dá)量最高，但與4齡、5齡幼蟲并沒有顯著性差異;3齡幼蟲體內(nèi)的基因相對表達(dá)量最低，但與2齡幼蟲并沒有顯著差異。對于MsABCC3而言，6齡幼蟲

4、體內(nèi)的基因相對表達(dá)量最高，與其他齡期均有顯著性差異，5齡幼蟲體內(nèi)的基因相對表達(dá)量最低，與4齡幼蟲相比差異顯著，但與2齡和3齡幼蟲并沒有顯著差異。在檢測4～6齡幼蟲中腸和除中腸之外的蟲體MsABCC2和MsABCC3蛋白基因表達(dá)量中，發(fā)現(xiàn)4～6齡的幼蟲中腸中MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的相對表達(dá)量均顯著的高于除中腸之外的蟲體，可以說明MsABCC2和MsABCC3大部分在黏蟲幼蟲的中腸處表達(dá)。
　　2.黏蟲ABC蛋白基因的

5、RNAi和沉默后的生物學(xué)測定
　　根據(jù)MsABCC2和MsABCC3基因序列分別設(shè)計(jì)了3個siRNA，分別為si2-1、si2-2、si2-3和si3-1、si3-2、si3-3，通過喂食法進(jìn)行RNA干擾。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了喂食了siRNA24h、48h和72h后MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的相對表達(dá)量，結(jié)果表明:喂食si2-124h后，幼蟲體內(nèi)MsABCC2蛋白基因的相對表達(dá)量相比對照顯著地降低了(P＜0.0

6、5）;喂食si3-1和si3-372h后，幼蟲體內(nèi)MsABCC3蛋白基因的相對表達(dá)量相比對照顯著地降低。在得到有效的siRNA的片段后，進(jìn)一步檢測了在沉默MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的表達(dá)后，其是否會影響?zhàn)はx對于Cry1Ac殺蟲蛋白的敏感性。結(jié)果表明，黏蟲幼蟲MsABCC2的表達(dá)被抑制后取食含有Cry1Ac毒蛋白的人工飼料，7天后其死亡率顯著低于對照組(P＜0.05)，且未死亡的幼蟲其體重也顯著高于對照。其結(jié)果表明，黏蟲對于C